植物生理实验.docVIP

PAGE 目 录 TOC \o 1-1 \h \u HYPERLINK \l _Toc274 实验一：硝酸还原酶（NR）活性测定 PAGEREF _Toc274 1 HYPERLINK \l _Toc6610 实验二：谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定 PAGEREF _Toc6610 3 HYPERLINK \l _Toc16041 实验三：谷氨酸合成酶（GOGAT）活性测定 PAGEREF _Toc16041 4 HYPERLINK \l _Toc7246 实验四：考马斯亮蓝G-250染色法测可溶性蛋白质含量 PAGEREF _Toc7246 5 HYPERLINK \l _Toc4756 实验五：苯酚法测可溶性总糖含量 PAGEREF _Toc4756 6 HYPERLINK \l _Toc21705 实验六：碘-淀粉比色法 PAGEREF _Toc21705 7 HYPERLINK \l _Toc22131 实验七：游离氨基酸总量测定 PAGEREF _Toc22131 9 HYPERLINK \l _Toc3024 实验八：细胞膜透性的测定 PAGEREF _Toc3024 11 HYPERLINK \l _Toc11415 实验九：水稻抗病性检测 PAGEREF _Toc11415 12 实验一：硝酸还原酶（NR）活性测定 一、实验原理 测定采用比色法，亚硝酸盐能与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或奈基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以μg/(g· h)为单位。NR的测定方法可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组分测定。离体法虽然步骤复杂，但重复性比活体法好，因此，在本实验中采用离体法。 二、试剂 亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml。然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1，即为浓度5μg／ml的亚硝酸钠标准液（亚硝态氮约1μg/ml）。 0.lmol/L pH 7.5磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g ，加水溶解后定容至1000ml。 1％（W/V）对氨基苯磺磷酸：称取1.0g 加入25ml 浓HCl中溶解 ，用蒸馏水定容至100mL。 2％（W/V）α－萘胺溶液：称取0.2g α－萘胺溶液溶于25ml 冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。 NADH2溶液：称取2.0mg NADH溶于1ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中（冰箱储存可用一个星期）。 提取缓冲液（25mmol/L的磷酸缓冲液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na混合液）：取250ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，加半胱氨酸0.61g，EDTA-Na 1.86g，溶解后用KOH调PH至7.5，定容至1000ml。 KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀(低温密闭保存)。 三、材料与方法 1．标准曲线的制作 取7支试管，编号，按下表顺序加试剂，即配成0~2.0μg的系列标准NaNO2淀标准液。摇匀在30℃水浴中或恒温箱黑暗保温30分钟。然后在540ml波长下比色测定光密度值。以亚硝酸钠含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 7 NaNO2淀标准液 (ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 1％对氨基苯磺磷酸（ml） 4 0.2%α－萘胺（ml） 4 每管含亚硝态氮（μg） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2．酶反应和酶活性测定 晴天上午9点后取材料2g，洗净剪碎，液氮研磨后加入预冷提取缓冲液（水稻每克鲜重4ml分两次加入）。4℃ 4000rpm离心5min。上清液即为粗酶提取液。 取0.4ml粗酶提取液，1.2ml 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液，0.4ml NADH2溶液加入刻度试管中混匀，在黑暗中30℃保温30min，对照组不加NADH2，以蒸馏水代替。 保温后立即加1ml 1%对氨基-苯磺酸溶液终止反应，加1ml 0.2%α-萘胺溶液，显色20min，离心10min，上清液在540nm处测光密度值。 四、结果处理 C：反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）； V1：提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2：酶反应时加入的粗酶液体积（ml）； W：样品重量； t：反应时间（h