分子克隆及细胞培养基本实验方法.doc

分子克隆及细胞培养基本实验方法 载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃ 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃ 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul） pAdTrack-CMV（ul） ①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶 HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃ ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃ ⑸-20℃ 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） 胶，尽可能去除多余的胶，称重； 加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； 水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 当DNA片段在500bp或4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； 结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； 洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm，1min，以去除剩余的乙醇； 将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； -20℃ 1.6连接反应 ⑴体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比） 反应组份 数量（ul） ①dd.H2O 8 ②T4 10×buff 2 ③载体ＤＮＡ（ul） 1 目的片段（ul） 8 ④T4DNA连接酶 1 Total : 20 ul ⑵16℃ ⑶直接用于转化或-20℃ 1.7感受态细胞的制备 菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp），37℃振摇4-6 hr 菌液冰浴10min，分装2管，离心（4℃，4 000-6 000rpm 弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心（4℃，4000-6000rpm 再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。菌体沉淀时，重悬操作要轻。 1.8转化 新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min； 42℃热休克90sec，勿摇动试管，再冰浴2min 加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37℃温和振摇45-60min 离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul上清； 剩余物重悬细菌，铺 Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。 1.9鉴定重组子 常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。 PCR反应体系： 试剂 数量 终浓度 ①dd.H2O 17.5 ul ②10×PCR缓冲液 2.5 ul 1× ③MgCl2（25mM） 1.5 1.5 mM ④dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM ⑤上游引物（25pmol