分子克隆实验报告.doc

分 子 克 隆 实 验 报 告 实验名称： 分子克隆、分子杂交、基因表达检测 实验类型： 综合性 指导教师： 李一博 班级： A 姓名： 孙阳阳 学号： 2014304110100 实验时间： 2015/8/19—2015/8/25 实验一 分子克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分 实验原理及方法 DNA提取：（CTAB法） CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。 质粒提取：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 ～ 107转化子/mg DNA。 酶切酶连：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段，经纯化处理后的DNA用于连接反应；选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验材料和试剂 携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液； 氨苄青霉素、卡那霉素； RNaseA； 碱裂解法试剂 Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 μg/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1 % Solution III: KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8 TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM 苯酚/氯仿、无水乙醇或异丙醇 主要实验步骤 两种载体的抽提 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的质量 两种载体的限制性内切酶消化 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子筛选及鉴定 实验结果与分析 质粒的质量检测，-20℃保存。 菌种 PUC19 M812 个人编号 5 6 7 8 5 6 7 8 浓度ng/ul 248.5 325.6 244.6 297.6 609.6 603.3 592.2 689.7 A260/280 1.88 1.86 1.81 1.89 1.86 1.83 1.86 1.80 电泳结果，只检测条带不有点marker M5、M6条带较亮有拖带，可能点样偏多 A260/280质较好，提取效果比较好 M5 P M5 P5 M6 P6 琼脂糖凝胶电泳点样顺序 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10