抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定-内科专业毕业论文.docxVIP

重庆医科大学硕士研究生学位论文抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 重庆医科大学硕士研究生学位论文 抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 摘 要 目的：登革病毒(Dengue virus，Dv)感染致死率高，登革热在世 界范围内发病率不断升高，而目前尚无有效疫苗和特效药物，因此登 革病毒感染的快速诊断有重要意义。登革病毒包膜蛋白E蛋白是重要 的抗原蛋白，与免疫保护密切相关。本研究通过原核表达纯化E蛋白， 利用杂交瘤技术制备DV—E特异性单克隆抗体，为进一步制备胶体金 试纸奠定基础。 方法： 1．采用PCR法扩增E基因片段，原核表达载体pET 32-a及PCR 产物经双酶切后，用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌 JM 1 09构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主BL2 1感受 态细胞，经IPGT诱导表达，对表达蛋白进行SDS．PAGE电泳分析和 Western．blot检测。以Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白。 2．用重组E蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤技术，制 备抗DV-E的单克隆抗体，用ELISA方法筛选分泌抗DV-E单克隆抗 体的杂交瘤细胞株，采用间接ELISA方法和Western．blot进行McAb 特异性鉴定；同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类，检测 McAb的效价。 重庆医科大学硕士研究生学位论文结果： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 结果： 1．采用PCR方法扩增得到与预期大小一致的目的基因片段。重组 质粒经PCR鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功，命名为pET 32．a．E。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为70kD的重组E蛋白， 与预期分子量相符。Westem．blot检测表明诱导表达的融合蛋白能与抗 DV的血清发生特异性结合。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化得到重 组蛋白。 2．成功筛选出一株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞7C7，其抗 体亚类为IgGl：将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb／c小鼠 腹腔中制备腹水型DV-E的单克隆抗体，酶联免疫吸附试验(ELISA) 证明腹水效价可达10一；Western．blot鉴定结果提示该单克隆抗体可以 特异结合DV-E。 结论：综上所述，我们运用重组DNA技术与原核表达方法获得了 重组E蛋白，利用该蛋白成功制备了抗DV-E单克隆抗体，所得抗体 具有生物学活性，其抗体亚类为IgG。。为进一步制备快速检测登革病 毒的胶体金试纸条奠定了坚实的基础。 关键词：登革病毒；单克隆抗体；生物学特性；E蛋白 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文PREPARATIoN 重庆医科大学硕士研究生学位论文 PREPARATIoN AND CHARACTERIZATIoN oF MoNoCLoNAL ANTIBoDY AGAINST DV ENVELoPE PRETEIN ABSTRACT o bj ectives：Dengue(DV)disease is a life—threatening disease．And nowadays the inciDVce of Dengue fever(DF)is increasing in the world． But we have had no utility vaccinum and specific medicine yet．So rapid diagnosis of the Dengue viral infection is important and emergent．The E protein，envelope protein．of DV is an important antigen protein and intimate to immunoprotection of Dengue infection．In this study,we constructed a prokaryotic expression vector to express DV-E in E．coli and obtained purified E fusion protein．Then，the specific monoclonal antibodies(McAbs)against DV-E were prepared by hybridoma cell techniques，which served as a basement of the gold colloid test paper． Methods： PCR was deployed to amplify E gene segment．After double enzyme digestion，prokaryotic expres