体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证.pptx

体内药物分析的样品处理和方法学验证1.为什么要对生物样品进行处理？2.有哪些生物样品？3.有哪些样品处理方法？各自的特点。4.如何对分析方法进行验证？5.有哪些参考标准？一、处理的目的生物样品进行前处理的目的在于：1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物。2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可靠性，必须对样品进行前处理。60%以上精力和花费用在样品前处理上二、生物样品的种类 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。1 全血全血不易保存，且血细胞中含有更多的干扰物质，影响测定，故很少采用全血测定药物浓度。仅适用于血浆药物浓度太低或者血浆药物浓度波动大，且难以控制的药物如：环孢霉素A。2 血浆测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血浆。血浆中含有的物质种类和比例3 血清 血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置15-30 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白，更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。 一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。 血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品检测中最常用的样本。4 尿液尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了保存，常会加入防腐剂。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢物及其缀合物等形式排出。尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。5 唾液唾液中所含成分比较简单，且容易获得，但是只有少数药物的唾液浓度和血浆游离药物浓度具有相关性，实际使用不多，当药物血浆结合率高的时候，唾液中药物的浓度极低，很难检测。生物样品的保存：采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。三、常用的处理方法主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和测定方法三个方面的问题。1.沉淀蛋白 PPT2.液液萃取 LLE3.固相萃取 SPE1.沉淀蛋白①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。 血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶剂，涡旋离心后，取上清进样；若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影响很大；常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。②加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率较高。③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。④加入锌盐或铜盐沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1: