酶法制备牡蛎活性肽及其诱导Hela细胞凋亡的研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 汕头大学硕士学位论文 I I 摘 要 目的：酶法制备牡蛎活性肽并探讨其诱导人宫颈癌 Hela 细胞凋亡的作用及机制。 方法：（1）采用响应面法优化了复合酶水解牡蛎蛋白的工艺。 （2）在温度 45 ℃、pH 8.0 的条件下，通过探讨底物浓度及酶浓度对水解度的影响， 建立酶解牡蛎蛋白的动力学模型。 （3）采用 Sephadex G-25 柱层析法对酶解液中的牡蛎活性肽进行分离纯化，并通过 Trcince-SDS电泳和凝胶过滤层析法测定其相对分子质量大小。 （4）以 SRB（Sulfordmaine B 磺基罗丹明 B）比色法，台盼蓝计数法，Hochest/PI 双 荧光染色法和 DNA Ladder 等技术方法检测 BPO（Bioactive peptides of oyster）诱导 Hela 细胞凋亡的方式，并采用流式细胞术和实时定量 PCR（RT-PCR）从分子水平上分析了 BPO 诱导 Hela 细胞凋亡的作用机制。 结果：（1）牡蛎蛋白的最佳酶解工艺为：温度 45 ℃、复合酶浓度 2 g/L、底物浓度 15.3 g/L、复合酶比（风味蛋白酶与胰蛋白酶活力比）为 2.3：1； （2）复合蛋白酶在温度 45 ℃、pH 8.0 的条件下，水解牡蛎蛋白的动力学方程及参数 为：水解速率模型 R=（40.301E0-0.425 7S0）exp（-0.217 6 DH）和水解度动力学模型 DH=4.5956 ln[1+（8.769 5E0/S0-0.092 63）t]，动力学失活常数 Kd=8.537 8 min-1 和米氏 常数 Km =3.741 mg/mL； （3）纯化得到牡蛎活性肽 BPO，并测得其相对分子质量为 751 Da； （4）BPO 能有效抑制体外培养的 Hela 细胞增殖，并具有浓度与时间依赖性；BPO 可 阻止 Hela 细胞 G1 期向 S 期的转化；BPO 能促进 caspase-3mRNA 和 caspase-10mRNA 表达 上调。 结论：BPO 能诱导 Hela 细胞凋亡，其作用机制与诱导凋亡基因表达上调和细胞周期阻滞 有关。 关键词：Hela 细胞；活性肽；动力学；凋亡；周期阻滞 II II Abstract Objective: To study the preparation of bioactive peptide of oyster (BPO) and investigate its effect and mechanism in apoptosis of human cervical cancer Hela cells. Methods: Optimization the enzymolysis of oyster protein by the Box–Behnken factorial design method. Under the condition of 45 ℃and pH 8.0, it is discussed that the influence of substrate concentration and enzyme concentration on the degree of hydrolysis .Therefore, a kinetic model was established. The peptides of oyster enzymolysates were purified with Sephadex G-25 gel chromatography. And the relative molecular mass of the peptides from oyster were checked by Trcince-SDSand gel filtration chromatography method. The access of apoptosis was studied by SRB method, cell count of trypan blue method, Annexin V-FITC/PI assay and DNA Ladder assay. And the apoptosis mechanisms of BPO in cancer Hela cells were analyzed by flow cytometer and Real-time PCR. Results: The optimal enzymolysis conditions of compound enzymes were: 45 ℃, enzyme concentrations 2 g/L, subst