酶分子的化学修饰.pptxVIP

酶分子的化学修饰;酶分子的化学修饰;一、概述;一、概述;二、原理、修饰剂及反应;1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 2）保护酶活性部位与抗抑制剂 部 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 ;3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： a. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 b. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。 ;4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 a. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 b. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。 ;2. 修饰剂及修饰反应;几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 ;烷基化反应;酰基化反应;连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。; 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 碘代： I2＋ ? + HI 硝化： (NO2)4C + ? +(NO2)3CH??;三、研究进展;2、定点突变和化学修饰结合技术 利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰，得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种化学修饰突变酶。;3、小分子修饰 蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，对酶的表面进行改造———改善酶的分散性；提高酶的表面活性；使酶的表面产生新的物理、化学、机械性能及新功能；改善酶与其它物质的相容性。 4、单功能聚合物化学修饰 最近研究发现，一种比PEG 更好的修饰剂非离子型两性聚氧乙烯十二烷基醚（Brij35）;5、辅因子引入 Sinha等采用固相合成技术对核糖核酸酶S 的C-肽的残基Phe8，用一种人工合成的氨基酸进行取代，其中吡哆胺磷酸作为辅因子。这种辅因子导入的方法比通常的修饰反应速度提高了70%。;酶化学修饰的应用 ——脂肪酶的化学修饰;实验步骤：脂肪酶PPL的PA修饰→PA.PPL修饰度的测定→脂肪酶水解活性的测定→酶的pH稳定性和热稳定性测定 细节注意：1.修饰度测定采用三硝基苯磺酸分光光度法测定（确定酶已修饰） 2.酶活采用橄榄油乳化液法测定．在40℃、pH 7.0的条件下，将每分钟从橄榄油中释放1 umol脂肪酸的酶量定义为一个酶活性单位(U）。 ;实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL，且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变化，均为7.0-8.0。;实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响—— 在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为40℃ ． ;实验结果分析： PA-PPL的pH稳定性—— 在pH 5．0或6．0的条件下放置1 h，原酶PPL基本上失去了活性，而修饰酶PA-PPL|失去了大部分活性，缓冲液pH为7.0和8.0时，PPL 和PA-PPL的活性随时间变化非常小，这说明它们的最佳存放pH是7.0-8.0。;实验结果分析： PA-PPL的热稳定性—— 原酶PPL和修饰酶PA-PPL在20 ℃下存放时，酶活性的变化很小，而在30 ℃下存放时酶活性明显降低，在40℃和50℃下存放时，酶活性迅速降低．40℃ 时PA-PPL的半哀期为95min，较PPL的半衰期延长了20min；50 ℃PA-PPL的半衰期为48 min，较PPL的半衰期延长了1倍．可见原酶PPL经PA修饰后热稳定性也明显提高 ;结论;附：参考文献;Thank You !