沙门氏菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白SseF与宿主细胞TIP60相互作用机制的研究-病原生物学专业毕业论文.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 博士学位论文中文摘要 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白SseF与宿主细胞TIP60 相互作用机制的研究 沙门氏菌是一种兼性胞内菌，它能够在细胞内一种膜性结构中存活和繁殖，这种 膜性结构称为包裹沙门氏菌的液泡(salmonellacontainingvacuoles，SCV)，SCV膜的 完整性及在细胞中的迁移与沙门氏菌的致病机理密切相关。细胞内的沙门氏菌通过一 种蛋白分泌系统，称之为Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion isystem，TTSS)，分泌和转 运一批效应蛋白，在细菌与宿主相互作用的过程中发挥重要的作用。在感染细胞后所 分泌的效应蛋白中，SifA，SseF和SseG对于维持SCV膜的完整性及在细胞内的运输 和定位过程中发挥至关重要的作用。已有的研究表明SifA通过调控液泡膜募集驱动 蛋白进而调控SCV的定向迁移，但是对于SseF的作用机制尚不清楚，因此本课题设 计实验寻找与SseF相互作用的宿主细胞蛋白，并进一步分析其机制。 为了寻找宿主细胞中SseF的靶蛋白，首先构建SseF的全长钓饵表达质粒，利用 酵母双杂交实验，通过顺序转化的方式转化酵母茵AHl09，筛选人肾eDNA文库， 没有找到相互作用蛋白，分析原因可能由于SseF蛋白结构中含有三个高度疏水的跨 膜结构影响了其在酵母细胞中的定位，从而影响双杂交结果，因此构建了SseF的截 短突变体钓饵表达质粒再次筛选人肾eDNA文库，发现SseF能够与宿主细胞乙酰基 转移酶TIP60特异性相互作用，这种相互作用进一步经pull．down实验验证。为了确 定SseF与TIP60相互作用的功能域，构建了一系列SseF的截短突变体，经酵母双杂 交及pun．down实验表明SseF50稍足以和TIP60相互作用。 为了探讨SseF和TIP60相互作用的分子机制，首先验证SseF是否作为TIP60的 底物，构建了SseF和TIP60的原核表达质粒，利用组蛋白乙酰基转移酶实验(histone acetyltranseferse assay,HAT assay)发现SseF能被TIP60乙酰化修饰。组蛋白乙酰基 转移酶活性缺失突变的TIP60不能使SseF乙酰化修饰。进一步做点突变分析表明 SseF第25位的赖氨酸是TIP60发生乙酰化修饰的特异性位点。 为了探讨SseF的乙酰化对其功能的影响，首先利用同源重组方法构建了沙门氏 菌染色体sseF全长缺失突变株和潜在乙酰化位点点突变株，分别使用个突变株和野 生株感染巨噬细胞，利用庆大霉素保护实验计算感染12小时后细菌在巨噬细胞中的 增殖率，结果显示，在染色体突变sseF潜在乙酰化位点后，发现沙门氏菌在巨噬细 胞中的增殖率较野生株相比降低了约50％，此点突变株的表型与sseF全长缺失突变 株表型类似。这些数据提示SseF的乙酰化修饰与其功能的发挥密切相关；进一步利 博士学位论文 博士学位论文 主窒垫里 用RNA干扰技术降低宿主细胞T口60的表达并观察对沙门氏菌感染细胞后相关表型 的影响，构建了siRNAT口60干扰载体，并通过蛋白免疫印迹技术和免疫荧光确定了 mRNAT口60干扰载体的感染效率。沙门氏菌分别感染干扰载体处理的Hela细胞和巨 噬细胞并观察宿主细胞T口60的表达对沙门氏菌感染相关表型的影响。结果显示，降 低宿主细胞中TP60的表达后，沙门氏菌感染的Hda细胞内观察不到Sifs的形成， 并且沙门氏菌在巨噬细胞中的增殖率显著降低。这些实验数据表明沙门氏菌感染宿主 细胞后，其分泌的效应蛋白SseF通过与宿主细胞乙酰基转移酶TD60特异性相互作 用并被乙酰化修饰，并且SseF的乙酰化修饰与其功能的发挥密切相关。 综上所述，本研究首次发现沙门氏菌感染宿主细胞后，其分泌的效应蛋白SseF 能够与宿主细胞的组蛋白乙酰基转移酶T口60特异性相互作用并且被乙酰化修饰，同 时找到了被乙酰化修饰的位点。利用同源重组技术进行沙门氏菌染色体SseF基因点 突变，进一步研究表明SseF的乙酰化修饰与其功能的发挥密切相关。以上研究丰富 了对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的认识及与宿主细胞相互作用机制的探讨。该研究将促 进理解微生物与宿主相互作用的机制，为细胞微生物学的研究提供新思路。 关键词：沙门氏菌；包裹沙门氏菌的液泡SCV；Ⅲ型分泌系统；效应蛋白；SseF； TP60； 乙酰化修饰 中图分类号：R373．2+1 2 博士学位论文