淋巴细胞基因表达谱揭示淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的分子机制-中西医结合临床专业论文.docxVIP

⑨楹旦大学复旦大学博士研究生学位论文 ⑨楹旦大学 复旦大学博士研究生学位论文 淋巴细胞基因表达谱揭示淫羊藿总黄酮重建衰老 免疫稳态的分子机制 中文摘要 背景与目的： 免疫衰老是老年个体感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等患病率、死亡率增 高的重要因素，亦是老年个体寿命预后的重要参数。衰老过程中伴随着免疫系统稳 态的打破，表现为免疫细胞数量减少、增殖能力下降、免疫反应性降低等。免疫稳 态在衰老进程中的成功重建，将有助于降低老年个体相关疾病的发病率、死亡率， 提高老年个体的生存质量，延缓衰老。 近年来，关于免疫衰老相关机制的大量研究结果表明，淋巴细胞过度凋亡及对 凋亡刺激的易感性增高是免疫衰老中免疫稳态失衡的重要分子机制之一。对于细胞 凋亡的认识随着分子生物学手段的不断完善而取得了飞速进展，人们已经认识到多 基因调控、多种信号传导途径的交互作用是细胞凋亡相关分子机制的重要特征。细 胞凋亡与细胞增殖虽互为对立面，但正常情况下，二者在体内处于动态平衡，以维 持机体细胞数量的平衡及自身的稳定。一旦二者之间的平衡被打破，就可能导致组 织细胞稳态失去平衡，进而产生相应的疾病。就免疫系统而言，细胞凋亡参与了免 疫衰老进程中淋巴细胞数量的减少、增殖能力的下降及免疫效能的减低等免疫稳态 的失衡，因此针对淋巴细胞凋亡进行的有效干预将有助于老年期免疫稳态的重建。 尽管许多研究已经表明细胞凋亡是免疫衰老的重要分子机制，但目前尚缺乏可 以调节免疫衰老进程中细胞凋亡与增殖失衡进而重建免疫稳态的有效手段，这正为 我们的研究提供了切入点。鉴于目前对于免疫衰老过程中相关调控基因表达的研究 局限于选取既定基因进行研究，而不能较全面地反应这一前提下基因表达的全貌； 此外，多数研究集中于对某些刺激诱导下淋巴细胞凋亡及相关基因表达的研究，尚 不能反应衰老个体体内淋巴细胞的基本状态及相关调控基因的基础表达。 故本研究拟在对老年大鼠脾淋巴细胞即刻凋亡(spontaneous apoptosis)百分率 进行定量分析的同时，采用高通量的基因芯片技术对老年大鼠脾淋巴细胞基因表达 ⑨狠霉大孽复旦大学博士研究生学位论文 ⑨狠霉大孽 复旦大学博士研究生学位论文 谱进行分析，目的在于尽可能全面地了解导致老年状态下免疫稳态失衡的基因背景。 同时我们进一步观察了淫羊蓉总黄酮(Epimedium Flavonoids，EF)对老年大鼠脾 淋巴细胞凋亡的影响，并分析了淫羊藿总黄酮干预后的老年大鼠脾淋巴细胞基因表 达谱，目的在于了解淫羊藿总黄酮重建衰老进程中免疫稳态的基因调控模式，全面 地阐明淫羊藿总黄酮重建衰老免疫稳态的分子作用机制。 材料 1、动物分组：实验用清洁级SD大鼠由复旦大学动植物科学部提供，23月龄 大鼠30只，雌雄各半，随机分为2组，即老年对照组(OC组)、淫羊藿总黄酮组 (EF组)：EF组给予EF灌胃，OC组同时给予蒸馏水灌胃，灌胃时间为3个月。 另设4月龄SD大鼠7只作为年轻对照组(YC组)。所有动物乙醚麻醉，无菌取脾， 分离脾脏淋巴细胞。 2、药物制备：本研究采用辽宁产朝鲜淫羊藿(Epimedium Kereanum Nakai)， 由上海市医药工业研究院中药室提取淫羊藿总黄酮。实验时以蒸馏水配制为 39／100ml的溶液，根据0．069／kgBW／d灌胃。 方法和结果 l、采用流式细胞技术结合Annexin V-PI双标记对老年大鼠、年轻大鼠及淫 羊藿总黄酮干预后的大鼠脾淋巴细胞即刻凋亡百分率进行定量分析。结果表明：年 轻大鼠淋巴细胞凋亡百分率为10．91±6．70，老年大鼠淋巴细胞凋亡百分率为25．81 ±9．1l，与年轻大鼠淋巴细胞凋亡百分率相比较，有极显著性差异(p0．叭)。淫羊 藿总黄酮干预后的老年大鼠淋巴细胞凋亡百分率为11．95±4-38，与老年大鼠对照组 淋巴细胞凋亡百分率相比较，有极显著性差异(pO．01)。因此，结果提示，盍生太 鼠生玺轻太鼠出越。甚盐巴细胞呈班垃度强亡：面淫芏薹总黄圈互显羞工调老生太 鼠滥巴细胞的过度颈亡。 2、采用全基因组的研究手段—基因芯片技术(Gene Chip Rat Genome U34A Set， Afrymetrix)结合MicroArray Suite 5．0、NetAtry等软件分析，比较并进一步分析老 年大鼠与年轻大鼠淋巴细胞差异表达的基因表达谱及淫羊藿总黄酮干预后的老年大 鼠淋巴细胞基因谱。结果表明： 老生太鼠皇生羟太鼠担比较，表达上调的基因有116个，表达下调的基因有215 个。结合我们研究的背景进行分析，老年大鼠淋巴细胞特征性的基因表达模式有以 下特点：(12县直促进细胞强亡佳田殴基因基达显羞上进，如：参与细胞凋亡发生中 心控制及效应环节的Caspasel、Caspase3；Calpain II；Dnase g