利用rnai技术研究ctsd和mmp1在鼻咽癌转移中的作用-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

博士学位论文利用RNAi技术研究CTSD和MMPI在鼻咽 博士学位论文 利用RNAi技术研究CTSD和MMPI在鼻咽 癌转移中的作用 博士研究生： 谢卫兵 指导老师： 姚开泰教授 中文摘要 鼻咽癌是我国南方五省及东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤之一，其发 病的分子机制仍未阐明。目前，普遍认为EB病毒感染、遗传因素和化学致癌 物是导致鼻咽癌发生的三大主要原因。 鼻咽癌的转移是导致鼻咽癌治疗失败的主要原因，但目前对于鼻咽癌转 移的分子机制人们知之甚少。因此，进一步筛选和鉴定鼻咽癌转移相关基因， 并明确其在鼻咽癌转移过程中的作用，对于揭示鼻咽癌转移的分子机制有着 重要意义，也对鼻咽癌的治疗及预后判断具有重要的理论和实用价值。 鼻咽癌细胞5-8F和6-IOB均来源于同一母细胞株SUNE-I，既往的研究 已经证实，5—8F具有高成瘤、高转移能力，而6-lOB则只成瘤、不转移。我 们实验室利用深圳微芯公司生产的8046个点基因芯片比较了5-8F／6一IOB之 间差异表达基因，获得一些差异表达的基因，其中cTSD和}JMPl为已知的转 移相关基因，芯片的数据提示这两个基因可能在鼻咽癌的转移过程中发挥重 要作用。 人CTSD基因的过度表达可促进癌细胞的生长和转移，是恶性肿瘤预后的 重要指标之一。文献报道该基因的过表达与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、大肠 癌、胃癌以及前列腺癌等的转移相关，同时也有文献报道CTsD在鼻咽癌转移 过程中发挥作用，但仍需进一步的实验证实其作用。 人h蚶’l基因在肿瘤演进的多个阶段均有作用，它影响肿瘤的起始、生长、 血管生成、进入血管／离开血管等过程。文献报道姗Pl基因的过表达与乳腺 癌、前列腺癌以及大肠癌等肿瘤的转移密切相关，也有研究显示MMPl也参与 算§ 中文摘要了鼻咽癌的转移过程。 中文摘要 了鼻咽癌的转移过程。 RNAi技术和可视化技术是近几年肿瘤研究领域发展起来的前沿技术。 RNAi是研究基因功能和进行基因治疗的全新技术，更是后基因组时代进行基 因功能高通量研究的强有力的工具。哈佛大学的研究者利用这一技术一次对 果蝇的16000个基因进行了发育相关功能研究，从中发现了300多个与发育 相关的基因，如果利用传统技术，这是无法想象的。另外由于RNAi具有高效、 特异的靶向作用与沉默机制，使其成为治疗某些传统难治之症(如恶性肿瘤、 AIDS等)的希望。 利用可视化技术建立的肿瘤动物模型可以帮助研究者在整体动物水平适 时观察肿瘤的生长、演进和转移的情况。该技术现已广泛应用于肿瘤转移以 及抗癌药物的研究等众多领域中，Hoffman领导的实验室利用可视化技术建 立了一系列的MetaMouse，为药物筛选和肿瘤转移研究提供了良好的动物模 型。我们实验室利用这一技术在国际上首次建成了可视化的鼻咽癌转移模型， 该模型是研究鼻咽癌转移的极佳动物模型。 本研究是在前期利用芯片筛选出在高转移鼻咽癌细胞株5-8F中高表达 的两个转移相关基因CTSD和MMPI的基础上，进一步利用RNAi技术和可视化 动物模型技术在细胞和动物整体水平上分析这两个基因在鼻咽癌转移过程中 的作用，为阐明鼻咽癌的分子机制提供直接证据。实验的方法和结果如下： 第一部分：利用RNAi干扰技术研究CTSD基因在5-8F-EGFP细胞的作用 采用pLentiU6慢病毒载体系统，构建了针对靶基因CTSD的1个RNAi 载体pLentiU6／gTSD 。经测序结果证实后，利用脂质体转染技术将 pLentiU6／CTsD一导入5—8F细胞，杀稻瘟菌素筛选获得抗性克隆，PCR证实 外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，荧光定量RT-PCR结果表明， pLentiU6／CTSD“表达载体能特异性的引起靶基因CTSD的表达下调，下调效 果为83％。进～步，Western Blotting分析表明整合pLentiU6／CTSD“细胞 中CTSD蛋白表达下调了70％，这些数据表明我们已成功地建立稳定转染 pLentiU6／CTSD“的5-8F细胞系。 为观察抑制CTSD基因的表达对鼻咽癌的生物学特性和转移能力的改变， Ⅱ 博士学位论文我们在细胞水平上观察了细胞的生长能力、细胞周期以及细胞侵袭转移能力 博士学位论文 我们在细胞水平上观察了细胞的生长能力、细胞周期以及细胞侵袭转移能力 等方面的改变。进一步利用可视化鼻咽癌转移动物模型观察了抑制CTSD基因 的表达后对鼻咽癌转移能力的改变。流式细胞分析结果表明，转染pLentiU6 空白载体的5—8P细胞与未转染的5_8F_E细胞的细胞周期分布没有明显改变； 转染pLentiU6／CTSD“的5-SF-EGFP细胞与未转染的5-8F—EGFP细胞比较， 细胞周期也没有明显的变化。这些数据表明抑制CTSD基因的表达对鼻咽癌细 胞株5-8F-EGF