IP实验简介解析.pptVIP

沈 健 2015.6.30 Immunoprecipitation（IP）and CO—immunoprecipitation（CO-IP） 免疫沉淀和免疫共沉淀 定义和基本原理 用抗体与相应的特定抗原分子沉淀，同时与该抗原分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的富集技术，就成为免疫沉淀和免疫共沉淀。 免疫共沉淀主要分为：细胞内过表达蛋白、细胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。 基本原理 在细胞或者组织裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于sepharose beads上的proteinA/G,与细胞中的抗体结合，形成一种复合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G,经过变性凝胶电泳，复合物分开。 最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。 Protein A 简介 Protein A:从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白。含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。具有不在抗原结合点而与免疫球蛋白结合的性质。能形成含有A蛋白、抗体、抗原的复合物。 Protein G:G型链球菌分离而得的细胞壁蛋白,能与多种动物(兔、大鼠、豚鼠、牛、猫、小鼠、鸟、羊)的IgG的Fc区发生结合，蛋白G还可以和某些抗体的Fab 和F (ab’)2 段结合。但不能与IgA和IgM结合。 Protein G简介 Protein A和G对鼠抗和兔抗的结合情况 基本的实验流程 免疫共沉淀实验流程 (1)蛋白样品准备 （如果为细胞样品需先裂解） (2)抗原抗体结合反应 (3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合 (4)免疫复合物与protein A/G 解离 （2%SDS煮沸处理） (5)分析鉴定 （Western Blot或质谱分析） IP是实验示意图 CO-IP示意图 免疫共沉淀技术的优点与局限性 优点： 与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效应；蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用；可以在天然状态下进行，可以避免人为影响，可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体. 局限性: 1.需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛选未知蛋白会遇到障碍。 2.免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白。 3.用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合适，与Western blotting或者ELISA相比容易出现假阳性反应。 4.灵敏度不如亲和色谱高。 5.不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结构的蛋白质一蛋白质相互作用。 IP检测基本示意图 IP实验流程 CO-IP实例