酶免疫测试(EIA)技术医学课件.pptVIP

* 模板来自于 * 酶免疫测试（EIA）技术 * 酶免疫分析技术（enzyme immunoassay,EIA）是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一种非放射性免疫技术，是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立的一种非放射性标记的免疫性标记分析方法。酶免疫分析系统则属于开放式的，符合标准的各种品牌的ELISA试剂盒均可应用，且有灵敏度高、特异性强、酶免疫试剂的性质比较稳定、操作方法简便、快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点。 * 酶免疫分析技术 非均相酶免疫分析 均相酶免疫分析 非均相液相酶免疫分析 非均相固相酶免疫分析 以聚苯乙烯制品作为载体的酶联免疫吸附实验---ELISA 一、酶免疫测试（EIA）技术分类 * 二、ELISA技术方法与原理 （1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。 （2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。 （3）根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法：双抗体（原）夹心法 ；间接法；竞争法 * ELISA测试原理 1）将链霉亲合素包被的聚苯乙烯塑料试管安置固定。 2）将生物素标记的特异性抗体和待测抗原加入链霉亲合素包被小管内，经温育，生物素和亲和素发生连接，待测抗原和特异性抗体发生结合，形成固相包被亲合素-生物素-特异性抗体-待测抗原复合物，然后进行洗涤，除去未结合的抗原和生物素标记抗体。 3）加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性抗体(酶标抗体)，经温育形成固相包被链酶亲合素-生物素-特异性抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，再次进行洗涤，除去多余的酶标抗体。 4）加入底物ABTS和H2O2，经温育，ABTS在辣根过氧化物酶的作用下显色，然后经波长450nm的光度计测定获得A值，从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 * 三、自动化酶标仪基本工作原理 光源 光路 微孔板 触摸屏电源 单 A/D转换 程控放大器 多路开关 光电检测 显示器 片 打印机 步进电机驱动 步进电机 送样机构 电源  机  图2 工作原理方框图 电源 * 四、ELISA操作步 （1）试剂的准备 （2）加样 （3）保温 使用恒温水箱 使用保温箱 （4）洗涤 （5）比色 * 五、ELISA质量控制 （一）的测试前标本的采集和保存 （1）可作标本广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可。 （2）标本采集时应尽量避免溶血，否则造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。 （3）抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。 （4）标本保存：血清置4℃冰箱5天内完成测试；一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀。 （5）ELISA的灵敏度1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫后做生化 。 * （二）仪器质控 （1）移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查，一般应在±10%以内； （2）水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差； （3）洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞； （4）酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 * （三）分析中质控 （1）加样 （2）温育 （3）洗涤 （4）显色 （5）酶标仪判读结果 * 六、ELISA操作注意事项 （1）测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温），并检查是否已经变质，同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀释液，若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。 （2）