HIV-1新发_急性感染者体内nef基因遗传进化与Nef特异性细胞毒性T细胞应答的研究 (1).pdf

CTGCTCCTAC一3‘ HIV-I8914．8884nt)，用于扩增HIV-1 HxB2 nef序列。 6、PCR反应产物纯化 Product凝胶成像后 取终产物5pl进行l％琼脂糖凝胶电泳，经Ultra-Violet Gel Extmction 与marker比对，确认所需片段，用QIAquikKit试剂盒纯化基因片 段。 7、TA克隆 Vector，转入化 扩增的nef基因600bp片段插入克隆载体pMDTMl8-TSimple 学感受态菌DH5a扩大培养，然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序j 8、序列分析 、 测得的序列用Contig软件对每个样品的全长nef核苷酸序列进行拼接。用 BioEdit软件进行编辑校J下，用ClustalX程序将样品序列nef区进行序列排列比 中HIV-I亚型参考序列，用MEGA 用Distances程序计算序列间的基因离散率，用SNAP在线工具分析同义替代及 非同义替代。 9、特征性氨基酸分析 ． 什进行重组断点分析。 10、统计学处理 ● 用SPSS17统计软件进行统计分析：用非参数检验(Mann．Whi tney检验)分析 不同setpoint组基因离散率；if]Pearson检验分析[4setpoint组，同义替代(ds)、 非同义替代(dN)以及dN／dS与调定点CD4的相关性。 ‘ 结 果 l、不同setpoint组感染早期病毒nef基因多样性比较 每例研究对象的观察点l克隆序列之间的基因离散率，反映了感染早期病毒的多 3 ● 0．0047_--4-0．0015，两组数据无统计学差异。提示了在感染早期，基因nef高度同源， 尚未明显分化，所以多样性不明显。 2、不同setpoint组感染早期核苷酸趋异性分析 观察点2为病毒复制从高峰下降后达到的稳定时期，观察点2nef基因clone 株与观察点l的clone株的离散率的差异，反映了感染早期阶段nef基因进化的 (0．0080+0．0030)的趋异性无明显差别。提示感染早期nef基因进化不明显。 3、不同setpoint组nef基因选择压力分析 在HIV-I的研究中，常用dN／dSratios来衡量选择压力，dN／dSratios大于l代表 阳性选择压力，dN／dS ratios小于l代表阴性选择压力。结果显示，setpoint点时 两组人群dS、dN，以及dN／dSratios均无显著性差异，发现dN／dSratios与CD4 计数有『F相关的趋势(R=0．653，P=0．015)。 ’ 4、不同setpoint组患者感染早期病毒逃逸突变差异的研究 除320527未发现明显突变外，其余研究对象均发生突变，不同感染者感染早期 nef蛋白突变存在差异。 5、不同感染者体内l司源瘸霉进化差异的矽F冗 二 通过流行病学及全长env基因分析发现12例原发感染者中存在2对同源传