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灵芝中一种DNase的特征和MT基因序列分析-植物病理学专业论文.docx 86页

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独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研 独创性声明 本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研 究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方 外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志, 都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人 承担应有的责任。 ㈨一椭躲砷盘掳日期 锎一ox—p f 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学校有权 送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅:学校可以公布论文的全部或部分内容,可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密,本论文属于不保密。 口 燃躲相娟/日叭旷’r 福建农林大学博士学位论文摘要 福建农林大学博士学位论文 摘要 灵芝(Ganoderma lucidum)含有丰富的活性物质,是2000年‘中华人民 共和国药典》收录的重要中药品种。目前,以灵芝为材料的研究主要集中在多 糖和小分子活性物质的提取及其功效方面,对功能性蛋白研究甚少。因此,从 灵芝中发现新的活性蛋白和基因对提高灵芝的药理价值、拓宽其应用渠道具有 重要作用。 本实验分为两个部分:I、灵芝中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其生物活 性分析。II、灵芝金属硫蛋白的基因克隆和序列分析。 I、灵芝中一种新的脱氧核糖核酸酶的纯化及生物活性分析: 1.分离纯化;主要通过硫酸铵盐析,亲和层析和离子交换层析方法从灵 芝中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶,命名为GLDNase。质谱分析其精确分子 量为13807 Da。SDS.PAGE检测为单亚基多肽,等电点为pH6.6,糖含量为2.7%。 2.N端氨基酸序列分析:GLDNase的N端的氨基酸序列为 PLDTGRYHl刑厂】吖cDGG。在GeneBank中采用Blast分析没有找到N端氨 基酸与其同源的多肽,说明GLDNase是一种新的蛋白质。 3.肽指纹图谱:经胰蛋白酶酶解后迸行肽质量指纹谱的分析,得到两个 肽段,其氨基酸序列分别为QVETvVDRLDEIJPIR和ESPGLQGVSSVPLR。序 列分析表明这两个片段分别与DNA聚合酶lI和二氢硫辛酰胺脱氢酶的部分氨 基酸序列存在较高的同源性。 4.脱氧核糖核酸酶活性分析:GLDNase可作用于超螺旋DNA,加NA, ssDNA和dsDNA。通过对超螺旋DNA,九DNA的作用与时间的关系分析, GLDNase可将超螺旋DNA切割成环状DNA和线状DNA;降解7.DNA时,没 有产生特异性条带,说明GLDNase是一种非限制性内切酶。 GLDNase酶活性依赖于二价金属阳离子Mg“,浓度为5 mmoL.L-1时活性 最高;10 mmoL.L1 EDTA可完全抑制其酶活性;GLDNasc最适pH范围为 pH8.0一pH9.0,pH8.4时活性最高:40℃时酶活性最高。 利用磷酸二酯酶I和磷酸二酯酶11分析GLDNase水解DNA产物末端的基 团为3’.OH,5’.磷酸。以上实验结果说明GLDNase与DNasel的酶活性质 相似,属于DNasel家族的一个成员。 福建农林大学博士学位论文5.抗烟草花叶病毒活性:采用半叶法测定了GLDNase对TMV侵染心叶 福建农林大学博士学位论文 5.抗烟草花叶病毒活性:采用半叶法测定了GLDNase对TMV侵染心叶 烟的抑制活性。GLDNase可明显抑制病毒枯斑,对TMV侵染心叶烟的抑制效 果呈剂量一效应相关性。GLDNase可干扰TMV抗体与抗原之间的结合,对 TMV外壳蛋白的抗原决定簇可能有一定的影响。 II、灵芝金属硫蛋白基因克隆和序列分析 金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸、低分子量的重金属结合蛋白。金属硫蛋 白具有很强的金属结合能力和氧化还原能力,在生物体内具有参与细胞内金属 水平的调节,重金属解毒、清除自由基等重要的生物学功能。目前还没有关于 灵芝金属硫蛋白基因的文献报道。 本文采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法获得了灵芝金属硫蛋白基因 的cDNA序列。GeneBank登录号EF489399。 该序列全长为389 bp,5i.端非翻译区为121 bp,3’.端非翻译区具有166 bp,开放阅读框长度为102 bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。 在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨 酸(Ser)和丙氨酸(Ala),均占12.1%。其编码的氨基酸序列具有金属硫蛋白 的保守序列模式cys.(x)1rcys。表明该序列具有金属硫蛋白的典型特征,是 金属硫蛋白家族的成员。灵芝与卷缘桩菇和双胞蘑菇的金

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