质粒图谱的阅读.pptVIP

基因工程（上游）大体步骤 第一节获得目的基因 直接分离目的DNA 经限制酶切割，电泳分离DNA片断。 适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。 真核生物的染色体DNA中含有内含子序列，不适合于基因工程的需要。 平末端连接的缺点 *more difficult ligation 连接困难 *2-direction insertion 双向插入 *self-reconnection 自身环化 *no easy way of retrieving the insert 重新筛选插入的片断困难 单酶切粘末端连接的特点 优点*Using the same one enzyme to cut 用同一种酶切 *Ligated easily and coveniently 连接容易方便 缺点*Self-reconnection of vector 载体自身环化 *Inserted in two directions 双向插入 单酶切粘末端的双向插入 双酶切粘末端连接的特点 *Using the same two enzymes to cut *Ligated easily and conveniently *no self-reconnection of vector *Inserted in one direction 定向插入 缺点 操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件不同，需要进行两个阶段的反应。 几种实验方法 利用相应的技术方法，使实验顺利进行。 外源DNA转入细胞的过程叫做转化。 但不包括由病毒介导的DNA转入 。常用的方法有两种： 其他处理受体细胞的方法 利用二甲基亚砜（DMSO）处理细胞 二巯基苏糖醇（DTT）处理细胞。 利用聚乙二醇（PEG）处理细胞。 完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。 当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5－溴－4－氯－靛蓝，使得菌落呈现蓝色。 使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。 Blue colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector and express a functional alpha fragment from an intact LacZ alpha coding sequence. White colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do not produce LacZ alpha fragment. 免疫法筛选 外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可与特异性的抗体结合。 氨基酸序列测定 测定N端的10－15个氨基酸 测定C端的5个氨基酸 样品需精制 价格较高 Direct selection 直接筛选 Antibotic resistance 抗菌素抗性 Marker rescue selection 借助颜色筛选 In situ hybridization 原位杂交 Immunology selection 免疫筛选 Immunochemistry method 免疫化学 Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析 质粒载体带有氨苄青霉素抗性基因，在宿主细胞内该抗性基因表达出可水解氨苄青霉素的酶，因而宿主细胞可在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长。 利用抗生素抗性筛选 复制起点 氨苄青霉素抗性基因 2.利用颜色筛选 插入失活现象 X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷 多克隆位点 半乳糖苷酶的基因内有多克隆位点，酶切插入外源DNA后，该基因无法表达. 表示外源基因插入编码半乳糖苷酶的基因区段 Target gene 蓝色菌落 无插入序列 白色