植物蛋白质的表达与纯化技术最终版.ppt

植物蛋白质的表达与纯化技术 The Expression and Purification of Protein in the plant 大肠杆菌包含体的形成 包涵体的形成：? ?主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 表达量过高： 研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对 ，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 重组蛋白的氨基酸组成： 一般说含巯基酸越多越易形成包涵体，氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 重组蛋白所处的环境： 发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 表达宿主的特性： 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对其的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具化学活性，而且影响负责 N 端加工的酶对表达蛋白的加工作用。因此，通常在经过差速离心得到包涵体后，必须对其进行变性和复性处理，以便得到具有正确构象和生物活性的蛋白质产品。 包含体有利的方面： ●可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 ●降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 ●包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离,有利于分离纯化。 ●对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于粘壁，并与细胞膜碎片分离。 融合表达： 表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译时才不会产生移码突变。通常，可构建一套表达载体，第一个载体有正常阅读框架，第二个载体多一对碱基，第三个载体多二对碱基。选择上述三种载体之一并与外源基因连接，以保证外源 DNA 阅读框架的正确性。 融合蛋白较易获得高效表达。融合蛋白的 N 端总是选择天然的高表达的宿主蛋白质，其 mRNA 具有较强的翻译能力。融合蛋白在细胞内比较稳定。外源蛋白特别是相对分子量较小的蛋白，通常在宿主细胞内极易被胞内蛋白酶所清除。但是如果外源蛋白与宿主的一个蛋白构成融合蛋白，就可保护外源蛋白不受宿主细胞降解。许多融合蛋白可用作抗原，但是获得的融合蛋白产物需要用化学法或酶法切去融合的多余肽段，给后处理工作增添了麻烦，因此在多数情况下人们还是愿意选择表达非融合蛋白。 标签： 很多标签是为了增加蛋白的可溶性，也有一些是为了方便鉴定表达产物，所以在表达时可以选择加标签。如果是表达一个没表达过的蛋白最好还是加标签，这样方便将来鉴定。如果从经济角度考虑最好加入6×组氨酸标签。 分泌表达： 在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包涵体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达： 大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包涵体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Nus·Tag，Trx·Tag和GST·Tag系统。 多个基因的表达： 要使多个基因共同表达可以采用多顺反子的结构共同表达，也可以构建多个表达盒进行共表达，或者分别在两个相容的质粒上表达。多顺反子的结构共同表达会受到线性调控，构建多个表达盒会增加载体的分子量，而且会造成启动子的竞争。 转录终止子： 对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB T7 噬菌体基因Ⅰ编码的T7RNA聚合酶选择性地激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成RNA