基因工程的发展历史分子生物学基础建立期.ppt

基因工程的工具及方法 限制酵素(restriction enzyme) 連接酵素(ligase) 載體(vector) 宿主(host) 限制酵素(restriction enzyme) 可從不同來源之DNA製造兩端帶有相同黏合端子(cohesive end)之核酸序列片段。 不同之限制酵素因認定序列(recognition site)之不同，分可切製200至數千個核甘酸之DNA，因而容許轉殖具有生物功能（基因）之核酸片段（通常一個基因約有1000個以上核甘酸）。以切割序列含有為七、六、五、四個核甘酸認定序列者，因切割後之DNA片段較大，較為有用。 連接酵素(ligase) 假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連接酵素有E. coli ligase及T4 ligase。這兩種ligases均可連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4 ligase更可連接blunt end之核酸片段。通常在基因轉殖之操作裡都使用可產生相同黏合端序列之限制酵素來切割質體及樣品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有互補之黏合端序列，故連接酵素就可把質體及樣品DNA片段結合，製成所謂之重組核酸(recombinant DNA)。 載體(vector) 一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核酸個體。 載體DNA的構造應含有的核酸序列： 1.在宿主裡複製(replication) DNA之複製子(replicon)序列。 2.帶有可供篩選重組核酸之標幟序列，如抗生素抗藥性或產生顏色反應之b-galactosidase等之標幟。 3.帶有多種限制酵素切割之區域(multiple recognition sites)，以供轉殖不同限制酵素切割之核酸片段。 載體之功能分類 具篩選標幟之載體(marker vector): 如pBR 322, pUC等系列載體，都帶有可供迅速篩選之標記；如b-galactosidase, luciferase,抗生素抗藥性等可供迅速篩選重組核酸之標幟。 轉運載體(shuttle vector)：如pMAN等載體，帶有能載細菌及動物間作核酸複製及基因表現之雙重功能，故可在不同生物間作基因轉移之操作。 核酸序列分析之載體(sequencing vector)：如pUC/m13及pUC/f1，pGEM-3Ef系列載體，因其可製造單股DNA，以供分析核酸序列，或可用已知之primer來迅速作核酸序列分析。 表現載體(expression vector)：如pET, pGEM, pEX等載體，帶有如SP6, T7, T3, lac等優良之啟動子，或帶有兩個不同方向之T7, SP6之啟動子以供基因表現製造蛋白。 載體之功能分類(continued) 特殊功能載體(special purpose vector)：如pCAT-promoter, pCAT-enhancer可用於分析真菌細胞之加強基因(enhancer)及啟動子之功能。 以l為基礎之載體：如lgt系列載體、EMBL系列載體，可供轉殖較大之核酸片段。 可利用於植物基因轉移使用之Agrobacter的Ti plasmid等。 若欲轉殖之核酸片段在10kb以下,則使用細菌載體(plasmid)，載10kb以上通常使用l系列之載體，若轉殖更大的片段則可使用黏接質體(cosmid)為載體。 宿主(host) 包括E. coli, 真核細胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統(baculoviral system)及動物細胞系統(mammalian system). E. coli作為宿主之優點為可在很短時間以最便宜之培養基來大量表現基因、製造蛋白，其製造成本最低，其缺點為E. coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關之功能，並且在E. coli內大量產生之蛋白常形成內涵體(inclusion body)之固體存在，缺乏生理活性，但以E. coli製造出來之製劑亦有：human insulin, a-interferon, IL-2.等 以yeast製造成功之例子有：HBsAg vaccine, G-CSF等 以動物細胞表現成功例子有：EPO, tPA, Factor VIII, Factor VII等 各種使用於基因工程之宿主特點比較 Expression of human insulin in E. coli Bacterial production of human growth hormone Bacterial production of human growth hormone (b) Production of a subunit