引物长度一般在5碱基之间.pptVIP

引物设计 冷 丽 2011-04-02 引物设计需要考虑的问题 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值(melting temperature) ΔG值(internal stability) 引物本身和引物之间二聚体及发夹结构 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition） PCR引物设计原则 1. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2. 引物GC含量在40~60%之间，Tm值最好接近72℃ GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即50%寡核苷酸双链解链的温度。一般有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 PCR引物设计原则 3. 引物3’端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 4. 引物3’端不能选择A。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引