目的基因的克隆转化及重组子筛选.docVIP

实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。 (6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW溶液、1μlpMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等 四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管 2管 3管 重量（g） 0.9045 1.2280 1.2961 净重（g） 0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴 7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的 SPW 溶液，放置 3min，10000g 离心 1min ，去残液； 7.10000g 离心 1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的 1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置 1min，10000g 离心 1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。 表二：cDNA吸光度测定 2组 3组 A260/A280 1.864 1.867 浓度（ng/μl) 146.718 128.242 （2）感受态细胞制备 1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37 ℃ 剧烈振荡培养过夜（教师准备）。 2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按 1：50 取1ml菌液接种到 50ml LB 培养基中，37 ℃ 振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182，1.5 hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期 OD 600 为 0.2-0.4）。 3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置 10 min，5000 r/min，离心 2 min ，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。 4.分别加入500μl预冷的 0.1 mol/L CaCl2 ，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的 CaCl2 中，冰上放置10分钟。 5.离心机5000