课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptVIP

1、 PCR（多聚酶链式反应）技术： 2、原理： 4.其它组分添加 DNA上清液10μL 10倍扩增缓冲液 5μL 25mmol/L MgCl2溶液3μL 20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1μL Taq聚合酶1μL 两种引物各0.5μL 蒸馏水29μL 预变性 94℃，5min 30次重复反应 94℃，30s 55℃，30s 最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 72℃，1min 5.PCR反应 变性 复性 延伸 6.PCR产物检验 分光光度计法 取2μL PCR DNA溶液，加入98μL H2O，使DNA５０倍稀释 以蒸馏水为对照，在260nm处测样品DNA的光吸收值 根据公式计算DNA含量 DNA含量（μg/mL）= 50×（260nm度数）×稀释倍数 结果分析与评价 　　根据公式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。 相关链接 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量 1.配制浓度为１％的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，插好梳子 2.向电泳槽中加入电泳缓冲溶液，移去梳子 3.在DNA中加入载样缓冲液，混匀后，滴加到样品孔中 4.接通电源，电泳20-40min + - 5.EB 溶液染色，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增情况 观察电泳带的粗细以及分布评价扩增的效果。 课堂小结 在体外制造与体内相同的环境，进行DNA复制反应 缓冲溶液 DNA模板 与两条模板链结合的两种引物 PCR原理 PCR反应条件 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 合适的温度 变性 复性 延伸 PCR反应过程 * 专题五 DNA和蛋白质技术 知识回顾 DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1、组成元素 脱氧核苷酸 2、基本单位 3、脱氧核苷酸结构 复习DNA复制的条件 解旋酶： 打开DNA双链 DNA母链： 提供DNA复制模板 4种脱氧核苷酸： 合成子链的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 引物： 使DNA连接脱氧核苷酸 ATP 1、DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 -OH端为3′ 磷酸基团的末端为5′。 DNA的双螺旋结构是如何形成的 2、复制过程解读 ① DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② RNA引物的合成, 以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物 ③ DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。 ④切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断 ⑤ DNA片断的连接 在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的子代DNA 1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物 2、 DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 想一想 思考： 能否在体外模拟体内DNA复制条件，进行DNA扩增？ 一、基础知识（一）PCR原理：阅读课本P58-59 DNA母链： 解旋酶(条件）： 4种脱氧核苷酸： DNA聚合酶（条件）： ATP： 引物： 缓冲溶液 适宜温度 3、PCR反应的条件 80—100℃： 耐热的DNA聚合酶： (二)PCR反应的过程 1、变性： 温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。 2、复性（退火）： 温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸： 温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。 PCR 循环第一步 ： 加热变性: 双链DNA解聚成为单链 模板序列 模板序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ： 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 模板序列 模板序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ： 引物延伸:合成新的DNA链 模板序列 模板序列 第1个 PCR 循环完成后 ： 得到两个拷贝的靶序列 1,048,576 20 1,073,741,824