高效液相色谱法-17概述.ppt

高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography,HPLC 第一节 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为： 液液分配色谱； 吸附色谱(液固色谱)； 离子交换色谱； 尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)； 亲和色谱、平板色谱(高效薄层色谱)等。 第二节 HPLC仪器 HPLC仪器包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 此外还配有 梯度淋洗、自动 进样和数据处理 装置。 第三节 HPLC流动相和固定相简介 一、流动相 与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 理想的溶剂应有下列特性： 1）对待测物具一定极性和选择性； 2）与检测器相匹配，如使用UVD溶剂截止波长要小于测量波长； 3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加； 4）化学稳定性好； 5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。 第四节 HPLC方法各论 按分离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。 一、分配色谱 1. 原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。 2. 流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。 * * 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 ?m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。 一、高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较： 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高： UVD---10-9g, 荧光检测器FD---10-11g。 二、HPLC与GC的比较 分析对象及范围： GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，为有机物总数的20%； HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，占有机物总数的80%。 色谱理论(Van’方程): GC (H=A+B/u+Cu)； HPLC (H=A+Cu)。 流动相的选择： GC为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小； HPLC为液体或各种液体的混合，它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度： GC需高温； HPLC通常在室温下进行。 三、 应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析。 因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 He 储液瓶 分布器 过滤 2?m 高压泵 入口检查 出口检查 脉流消除 抽气 过滤器 反压调节 压力计 注样阀 分离柱 到检测器 HPLC仪器详解 一、 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 ?m，可防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、