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PMI基因作为选择标记植物表达载体构建和转化白花丹参体系建立 ［摘要］目的：构建含有大肠杆菌6-磷酸甘露糖异 构酶(6-phosphomannose isomerase, PMI)基因并替换潮 霉素抗性(hygromycin , hyg )基因的植物表达载体 PCAMBIA1305-PMI,同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白 花丹参转基因体系。方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5a中克隆PMI基因，然后以PMI基因替换植物表达载体 PCAMBIA1305中的hyg基因，构建了以PMI基因为选择标记 基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,并用电击转化方法 导入根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中， 用叶片浸染法转化白花丹参。结果：在白花丹参MS+6-BA 1. 5 mg ? L-1+NAA 0. 1 mg ? L-1固体分化培养基中附加20 g ? L-1 甘露糖和10 g-L-1蔗糖为碳源的选择压力下， PCAMBIA1305-PMI的转化率为23. 7%,对再生植株用PCR检 测证实了 PMI基因的导入。结论：建立了以PMI-甘露糖为选 择系统的白花丹参转基因体系，可应用于后续目的基因的转 化奠定了基础。 ［关键词］6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因；甘露糖； 白花丹参；转基因筛选标记 传统方法获得的转基因植物中存留的抗生素筛选基因 可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引 起基因污染。虽然目前还没有关于标记基因迁移带来危害的 报道［1］,但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一 直颇具争议。因此，培育具有无抗生素的生物安全性标记基 因的转基因植株势必成为未来植物转基因的重要发展方向。 6-磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase, PMI) 基因编码6-磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化6-磷酸甘露 糖转变为6-磷酸果糖。自然界的植物大多没有PMI基因 (manA),在含甘露糖的培养基上，内源果糖激酶催化甘露 糖磷酸化为6-磷酸甘露糖，从而使ATP大量消耗。而催化 产物6-磷酸甘露糖不能被植物细胞利用，当其积累到一定 程度时就会对细胞生长起到抑制作用。只有转入了外源PMI 基因的转化细胞才能继续代谢6-磷酸甘露糖，并生产出 ATP,为细胞正常生长提供能量。所以，甘露糖在遗传转化 中是一个有用的选择剂，使用PMI基因作为筛选方式的转基 因系统要求在含有甘露糖的培养基上有生长优势。PMI作为 新型安全的选择标记应用于植物的遗传转化，筛选程序简 单、筛选剂价格低廉，而且不影响转化植株的代谢平衡和生 长发育，不利变异少，筛选效果显著，对人体和环境无污染, 在单子叶植物和双子 叶植物中均适用。利用此正选择系统转化甜菜，其转化 频率是卡那选择系统的10倍［2］。另外在白菜、油菜籽、 杨树和杏树等多种植物的基因工程研究中也有应用[3-7] o 白花丹参 Salvia miltiorrhiza bge? f. alba C. Y? WU et H. W. Li是紫花丹参的变型，为山东特产药材之一。已做 为一个新品种被收录进《山东省中药材标准》（2000年版） [8-9] o白花丹参与丹参的化学成分基本相同，含有脂溶性 成分丹参酮类，水溶性成分酚酸类，可以作为丹参的替代品。 甘露糖为筛选剂的转化丹参的研究未见有报道。本研究首先 构建了以PMI基因作为筛选标记的植物表达载体并转化白 花丹参，以期建立起具有生物安全性的白花丹参转基因体 系，为白花丹参的遗传改良提供技术资料。 1材料 大肠杆菌 Escherichia coli DH5 a、农杆菌 LBA4404 和 植物表达载体pCAMBIA1301由本实验室保存。pMD18-T Vector载体.Taq DNA聚合酶、DNA限制性内切酶.DNA Marker DL15000购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试 剂盒等购自宝生物公司。 2方法 2. 1植物表达载体pCAMBIA1305-PMI的构建 用引物 PMIF 5’ AAAACAGGGATTGATCAT 3’ 和 PMIR 5’ TTTCAGTAAGCTCTTACAGC 37从大肠杆菌基因组中扩增PMI 基因，然后连接到pMD18-TVector得到pMD18-T-PMI载体， 测序验证。然后用带有Xhol接头的引物 PMIxhou5 AGTCTCGAGATGCAAAAACTCATTAAC3z 和 PMIxhol5, CAGCTCGAG TTACAGCTTGTTGTAAACA 3’ 扩增 pMD18-T-PMI 质粒，将 PCR 产物连入 pMD19-T simple 质粒, 得到 pMD19-