棉花黄萎病菌落叶型菌系在山东的分布、毒素测定及生防细菌筛选研究-植物病理学专业论文.docxVIP

目 目 录 中文摘要 ．I ABSTRCT ．． ．．．III 1引言 ．1 1．1棉花黄萎病的发现与分布 ．1 1．2棉花黄萎菌的寄主范围及其危害 一1 1．3棉花黄萎病的发病特点及特征 ．．3 1．3．1普通型 一4 1．3．2落叶型 一4 1．4棉花黄萎病原菌研究 ．4 1．4．1棉花黄萎病菌的形态 4 1．4．2黄萎病原菌生理特性研究 一5 1．5棉花黄萎病菌致病力的研究 ．6 1．5．1棉花黄萎病菌的鉴别寄主法研究 6 1．5．2棉花黄萎病菌其他检测技术 ．．9 1．5．2．1营养亲和性研究 9 1．5．2．2同工酶研究 ．10 1．5．2．3分子生物学技术 ．10 1．6棉花黄萎病菌致病机理 13 1．6．1导管堵塞学说 13 1．6．2毒素学说 13 1．7棉花黄萎病菌毒素研究 13 1．8棉花黄萎病的防治 ．j ．15 1．9本研究的目的意义 16 2材料和方法 ．．1 8 2．1试验材料 1 8 2．1．1植物材料 ．1 8 2．1．2菌株及质粒 ．1 8 2．1．3生化和分子试剂 1 8 2．1．4实验仪器 2．1．4实验仪器 一1 8 2．1．5实验用培养基 ．18 2．1．6实验用溶液和试剂 19 2．2方法 21 2．2．1棉花黄萎病标本采集 21 2．2．2病原菌的分离和纯化 2l 2．2．2．1病原菌分离 ．21 2．2．2．2单孢分离及病菌纯化 ．21 2．2．3病原菌培养性状观察 21 2．2．4黄萎病原菌基因组DNA的提取 ．21 2．2．4．1菌体培养 ．21 2．2．4．2基因组DNA的提取步骤 一22 2．2．5棉花黄萎病原菌致病型的分子鉴定 22 2．2．5．1特异性引物的设计及合成 一22 2．2．5．2 PCR扩增反应体系和条件 ．23 2．2．6不同菌株致萎毒素的毒性测定 25 2．2．6．1供试黄萎菌株 一25 2．2．6．2菌体培养 ． 25 2．2．6．3毒素的提取 ．25 2．2．6．4毒素含量的测定 ．25 2．2．6．5毒素对棉花种子萌发抑制的测定 ～26 2．2．6．6毒素对棉花幼苗致萎作用测定 ．26 2．2．7生防细菌对棉花黄萎病菌拮抗活性的测定 一27 2．2．7．1生防细菌的筛选 一27 2．2．7．2拮抗细菌与黄萎病原菌对峙培养 ．27 2．2．7．3生防细菌DNA基因组提取 27 2．2．7．4生防细菌鉴定 一28 3结果与分析 30 3．1棉花黄萎病菌菌落形态观察 30 3．2棉花黄萎菌的分子检测 36 II 3．3棉花黄萎病菌非落叶型菌系分子的检测 3．3棉花黄萎病菌非落叶型菌系分子的检测 37 3．4棉花黄萎病菌落叶型菌系分子检测 37 3．5毒素含量测定 38 3．6毒素对棉花种子萌发的影响 39 3．7毒素对棉花幼苗致萎作用测定 40 3．8生防细菌的鉴定 41 3．9生防细菌对黄萎病原菌抑制作用的测定 43 4讨论 44 5总结 ．47 参考文献 一48 致谢 58 III 山东农业大学硕士学位论文中文摘要 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 棉花黄萎病是山东棉花生产中最严重的病害，年发生面积700多万亩，常造成巨大 的经济损失，直接影响我省的棉花生产。近年来，棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae． 胁6)的致病力发生了明显变化，特别是落叶型菌系在田间的广泛出现，对我省的棉花 生产造成越来越严重的影响。因此，了解落叶型菌系的特点及其在山东的分布，对有效 控制棉花黄萎病的发生及传播，具有十分重要的意义。 本研究从山东德州、东营和泰安等地棉花黄萎病发生田采集病株样品，经分离纯化， 获得202株分离物，经培养性状观察、特异性引物扩增及致病力分析，发现落叶型菌系 在我省分布十分广泛。对部分菌株的产毒能力及致病力进行了分析，发现各菌株产毒能 力有较大差异。从不同地区采集土壤样本，筛选、鉴定出对黄萎病菌有明显拮抗作用的 细菌菌株8株，为进一步对棉花黄萎病的生物防治提供了菌株材料。具体研究结果如下： 1．于棉花黄萎病盛发期，从山东德州、东营、泰安等地采集棉花黄萎病标本，采用 组织分离法，获得202株分离物。 2．对各菌株的培养特征观察表明，202株分离物中，201株为菌核型，菌落黑色、 白色气生菌丝稀薄或浓密，产生大量微菌核；l株为菌丝型，菌落白色、菌丝棉絮状、 无微菌核和黑色素产生。 3．用大丽花轮枝菌(Verticillium dahliae)特异性引物DB 1 9／DB22对202株分离物 进行PCR扩增，发现所有分离物均可扩增出一条530bp左右的特异性条带，表明202 株分离物均为E dahliae。 4．为分析落叶型菌系在山东的分布，分别用2对特异性引物(INTD2f／INTD2r和 INTND2f／INTND2r)