用亲和层析策略解决质粒DNA纯化的难题.ppt

用亲和层析策略解决质粒DNA纯化的难题 生物系第二组 王亮根 前言 pDNA结构 pDNA主要以cccDNA形式存在 pDNA 色谱法 pDNA的亲和层析 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他生物大分子分开，达到分离提纯的目的。 金属螯合亲和层析（IMAC） 三重螺旋亲和层析（ THAC ） 蛋白质DNA亲和层析 氨基酸的DNA亲和层析 金属螯合亲和层析（IMAC） 基于与固定化金属离子亲和差异 螯合物：次氮基三乙酸（NTA）/亚氨基二乙酸（IDA） 常用金属离子：Ni(II) & Cu(II) 选择性通过芳烃碱基上的氮与金属离子的相互作用吸附单链核酸 与固定金属离子亲和力顺序为：内毒素>RNA>pDNA 主要缺点 ：从gDNA中分离pDNA只有在gDNA因结构不稳定而暴露碱基并加强相互作用情况下才有可能 适合：纯化质粒DNA和核糖核酸；从PCR反应的产品清除引物和污染物；检测异源双链DNA中的错配 三重螺旋亲和层析（ THAC ） 是基于该序列特异性相互作用的三螺旋形成 寡核苷酸的质粒DNA Wils等人研究的质粒pXL2563纯化的特殊情况， (GAA)17能和 (CTT)7在酸性条件下结合→用THAC纯化scpDNA的可能 蛋白质DNA亲和层析 第一个例子：蛋白质-DNA色谱法的应用，使用双功能蛋白的亲和力连接组成的一个锌指DNA结合蛋白（融合谷胱甘肽S -转移酶(GST-ZF) ）将孤立的质粒DNA直接从原油裂解物。 　ZF 结构域结合5’-GGGGCGGCT-3’，GST 结构域结合到带有谷胱甘肽的Sepharose 亲和基 另一策略： pDNA连接的Lac 操纵子序列和抑制子Lac I 蛋白相互作用 氨基酸的DNA亲和层析 His&Arg作为配体可分离sc pDNA His亲和方法获得的pDNA纯度高：gDNA和内毒素污染在可接受的水平上，并没有检测蛋白质&RNA ；转染实验中使用此法纯化的pDNA还证实，它可以有效地驱动基因在真核细胞中表达；pDNA结合能力是合理的和可比的。 主要缺点：产量低和高盐浓度需要洗脱 Arg作为配体可能更好←Arg-base相互作用在多数pro-DNA结构为最普遍 ４种方法的比较 结论与展望 以符合严格的质量保证需要治疗质粒DNA生产，更有选择性的，可靠的和高效率的纯化过程，需要将允许获取质粒产品提供必要的纯度。 质粒DNA从宿主细胞提取分离很复杂，杂质与质粒DNA结构 和化学性质相似→质粒DNA的选择性纯化遭遇困难。 强调质粒DNA纯化的亲和层析法的潜力。 THAC及蛋白质-DNA亲和层析法利用高度特异性相互作用来纯化质粒DNA，高效地从dDNA分离sDNA。↘不足以从pDNA中分离 gDNA或分离 不同的pDNA同形物。 在我们看来，的亲和层析法前景更好← 它结合与单一简单的小分子自然发生的生物相互作用的选择性。 ↘支持的质粒DNA容量低是仍待解决的问题，以及由于质粒DNA样本分子量大使其扩散率低。 * * * *