课件：免疫组化双重染色技术.pptVIP

* 2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: 先显示HRP, 再显示AKP或葡萄糖氧化酶. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 必需排除两套抗体系统之间的交叉反应. 如第二种羊抗兔IgG二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双标记, 因此应事先做抗体进行交叉染色实验. * 5. 染色步骤: 以先后使用PAP法和APAAP法为例. a. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭如前. b. 两种一抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分或4℃过夜. TBS洗两次, 每次5~10分. c. 两种二抗混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分. TBS洗同上. d. PAP和APAAP混合液(各自稀释度由单染色决定), 室温30分. TBS洗同上. e. 显示HRP, 如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色. TBS洗同上. f. 显示AKP, 如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝BB, 镜下控制染色. TBS洗同上. g. 甘油胶封片. * 6. 注意事项: a. 过厚切片(7?m)可能出现混合色(双标记)的假象. b. APAAP法中缓冲液用TBS而不用PBS, 或至少在显示酶活性的一步中用TBS. c. 内源性AKP一般不会引起问题. d.