IL-8生物活性的检测.pptVIP

* * IL-8生物活性的测定 基本原理： IL-8是典型的CXC家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化 作用。IL-8的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细 胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。 趋化因子诱导的细胞移动方式有两类： 化学增活现象，指增强细胞的随机运动，琼脂糖小滴化学动力实验是 检测这种活性的比较简易，快速，重复性好的方法。 趋化性，指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。琼脂糖中的 趋化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性 的方法。 微孔小室中的趋化实验： 微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞 或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计 的。滤膜将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下 面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在 膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。 趋化材料和趋化时间的选择： 趋化滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择；中性粒细胞用3μm孔径的 PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes）, 趋化时间为30分钟；单核细 胞用8μm孔径的PVPF聚碳酸膜，趋化时间为90分钟；粘附力弱的淋巴细胞则 用表面复以明胶或纤粘素的5μm或8μmPVPF聚碳酸膜，以免淋巴细胞穿过膜 后落入下室，趋化时间为180分钟。 不同趋化因子浓度的确定： 趋化因子特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞 趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续5倍或10倍系列稀释 以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照，因为不同 来源或活力靶细胞的趋化能力差异很大 趋化因子活性的表达方式有三种， 其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数（chemotactic index,CI） 是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值。 试剂和材料： 纯化的IL-8 注射器，离心管，移液器，Tip头 0.17% D(+)-糖原/生理盐水 解剖器械（剪刀，镊子，止血钳） PBS, 红细胞裂解液 趋化小室，趋化滤膜，细胞刮子 Serum-free RPMI1640 计数板，玻璃片，显微镜， 甲醇，Gimsa染色液 红细胞裂解液： 豚鼠中性粒细胞， 0.17M Tris/0.16MNH4Cl 液体石蜡， 将10ml0.17MTris加到90ml 0.16M NH4Cl中，调PH7.2 实验程序： 一豚鼠嗜中性粒细胞的制备 ： 1）取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理盐水，13小时后，用PBS缓冲液冲洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min 10min,弃上清。 2）轻轻弹起沉淀，用3-5ml PH 7.2的37℃预温的（ Tris-NH4CL） 红细胞溶解液，充分吹散，作用3-5分钟，立即加入10-15ml serum-free RPMI1640,吹打均匀，1500rpm/min 5min,弃上清，再加入serum-free RPMI1640,离洗两次。得到豚鼠嗜中性粒细胞，纯度可达97%以上。 3）将纯化后的嗜中性粒细胞溶在serum-free RPMI 1640中，细胞计数，调整细胞浓度为5x105/ml，备用。 二．样品的准备： 将纯化的IL-8用PBS分别稀释为 1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。 同时用稀释IL-8的PBS作阴性对照。 （样品加入小室前最好放入37℃培养箱中预温， 以免加样时出气泡）。 2 3 4 5 6 7 IL-8(1μg) PBS PBS PBS PBS PBS PBS 180μl 180μl 180μl 180μl 18