核酸分子杂交研究生课程.pptVIP

内容提要 随机引物标记 DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3′末端标记 5′末端标记 一、设计原理 一、设计原理 一、设计原理 （一）液相杂交 （二）固相杂交 （三）原位杂交 （四）基因芯片技术 1.菌落杂交 4.点杂交和狭缝杂交 DNA样品点到滤膜上 1 变性 2 中和 3 固定DNA 4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影 探针DNA 探针标记 变性 将探针加到固定的DNA上 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量 1）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。 5. 原位杂交 末端标记 3’-末端标记 5’ 3’ 3’ 5’ 5’末端突出的DNA 5’ 5’ 3’ 3’ 3’末端标记的DNA 完整双链DNA KlenowDNA聚合酶 32p—dNTP 变性 32p末端标记的 单链DNA探针 末端标记 5’-末端标记 乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针。 五、探针的纯化 第三节 杂交类别与应用 三种印迹技术的比较 点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 Northern 杂交 Southern杂交 反点向杂交 一、MASA液态芯片 二、杂交的基本分类 MASA是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应，并以100种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体，是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测。 MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力 二、杂交的基本分类 概念：反向点杂交(reverse dot blot， RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，是将探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩增产物中是否含有目标基因的技术。 二、反点向杂交 原理与应用：RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特异性扩增的产物，在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交； 待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。 一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。 2.Southern blot 3.Northern blot 4.点杂交和狭缝杂交 5.荧光原位杂交 6.基因芯片 1.菌落杂交 三、固向杂交 分子杂交实验 ① ② ③ 2.Southern blot 2.Southern blot DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离 膜上固定DNA片段 在缓冲液中将标记的探针加到膜上 DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上 杂交信号的检测 2.Southern blot 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 待测核酸样品的制备 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记 待测DNA样品的电泳分离 凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。 Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相