应用酵母双杂交系统发现hALR与Na-ATPase间的相互作用3.PDFVIP

( ) ·3 10 · 中国病理生理杂志 　Chinese Journal of Pathophysiology 　2003 ,19 3 : 310 - 313 ( ) [文章编号] 　1000 - 4718 2003 03 - 0310 - 04 应用酵母双杂交系统发现 hAL R 与 Na + , K+ - ATPase 间的相互作用 1 2 2 1 佟明华 , 　 陈思强 , 　姚汝华 , 　孔祥平 ( 1解放军第 458 医院传染病中心 ,广东 广州 510602 ; 2 华南理工大学生物工程系 , 广东 广州 510641) ( ) 　　[摘 　要] 　目的:采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子 hALR 相互作用的蛋白质 ,探讨 ALR 的作用机 理 。方法 :构建 hALR 诱饵质粒p GBKT7 - hALR ,醋酸锂法转化AH109 酵母菌 ,转化菌在 SD/ - Trp - His 培养基上培养 及滤纸法β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后 ,与人肝 cDNA 文库质粒预转化的酵母菌 Y187 进行接合试 α α 验 ,接合产物在 QDO 培养基上筛选 ,阳性克隆进一步在含 X - - Gal 的QDO 平板上鉴定 ,X - - Gal 活性呈阳性的克 隆 ,进行 PCR 及酶切鉴定排除完全相同克隆 ,进一步进行回交试验排除假阳性 ,对阳性克隆进行序列测定和生物信 息学分析 。结果 :得到数个阳性克隆 ,序列分析结果表明其中 1 个阳性克隆是 Na + , K+ - ATPase β亚基部分基因 ,长 669 bp ,3′端非编码区224 bp ,编码区长 445 bp ,编码Na + ,K+ - ATPase β亚基 C 端的 147 个氨基酸残基 。结论 :应用酵 母双杂交系统筛选出Na + ,K+ - ATPase 与 hALR 具有相互作用 。 [ 关键词] 　肝再生增强因子 ;酵母双杂交 ;Na + ,K+ - ATPase 　　[ 中图分类号] 　Q78 　　　　　[文献标识码] 　A 　　自1994 年 Hagiya 等[ 1] 首次发现肝再生增强因 测到蛋白质之间结合常数低至 1 mmol/ L 左右的微弱 ( ) 作用 。再次 ,省略了其它体外检测蛋 白质之间相互 子 augmenter of liver regeneration , ALR 以来 ,人们对 其体外重组 、生物学功能等进行了较广泛的研究[2 ] , 作用所必须的蛋白抽提 ,纯化等步骤 。该技术随着 表明ALR 与肝再生密切相关 ,其作用机制尚不十分 人们的广泛应用 , 已不断得到发展 。现已推出第三 清楚 。Wang 等[3 ] 发现肝细胞表面及细胞器膜上存 代酵母双杂交系统 ,该系统在菌株和载体上做了大 在 ALR 的特异性受体 ,分子量约 75 kD 。认为 ALR 量的改进 , 使其能更好地消除假阳性和便于操作 。 通过其肝细胞表面的特异性受体 , 以 EGF 受体为中 为了探讨 ALR 在肝脏中的生理作用机制 ,我们拟