吲哚乙酸氧化酶活测定.ppt

实验六、吲哚乙酸氧化酶活性的测定 南京师范大学 生命科学学院 一，实验目的与要求 了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分布； 掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性的方法。 二，实验材料与试剂 1，材料 绿豆幼苗的下胚轴。 2，试剂 20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)； 1mmol/L的2、4-二氯酚； 1mmol/L的氯化锰； 200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）； 试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)， (使用前混合，避光保存）。 三、实验原理 1、知识背景 知识背景：植物的生长物质 定义：调节植物生长发育的物质。 分类： 1、植物激素（plant hormone） 在植物体内合成、并从产生处运送到别处，对发育产生显著作用的微量有机物； 2、一些具有植物激素活性的人工合成物质。 五大类激素的生理功能 五大类激素的产生部位 生长素是什么 生长素的发现 Darwin的向光性实验 詹森的实验（1910）和拜尔的实验（1914） F.W.Went的实验 结论： 胚芽鞘顶端能产生化学物质，向下传输到去顶胚芽鞘，并影响后者的生长； Went称这种化学物质为生长素 ； 1934年首次提取纯化出刺激生长的物质，经鉴定为吲哚乙酸（IAA）。 生长素的生理作用和最适浓度 生长素浓度的调节方式： 生长素的结合： 束缚生长素 自由生长素 生长素的降解： 2、综上所述 吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。 生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。 酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即： IAA氧化酶活力 = IAA减少的速率 3、实验设计 在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最大光吸收峰。 三，实验步骤 1，提取IAA氧化酶 称取0.5g绿豆下胚轴，分次加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）5mL，冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液。 2，IAA氧化酶与IAA的反应 3，测定IAA氧化酶活性 混合试剂B： 0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50) 30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按表加入反应液orIAA的梯度浓度溶液各2mL 。 4.制作标准曲线 5、结果计算 以0~6管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA浓度。 IAA氧化酶活性 （ugIAA/g FW.h) 四、思考题 步骤（一）中为何取材时去除子叶与胚根，留取胚轴？ 反应混和液为何中加入氯化锰和2、4-二氯酚？ IAA氧化酶在植物的生长发育过程中一般起着什么作用？为何在生产实践中一般不用IAA，而用NAA或2、4-D等生长调节剂？ * * 促进生长、 促进生根、发芽 生长素 促进果实的成熟 乙 烯 抑制细胞分裂、促进叶、果实衰老脱落 脱落酸 促进细胞分裂 细胞分裂素 促进细胞伸长、促进种子萌发、果实成熟 赤霉素 主要生理作用 种 类 主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子 生长素 植物体各个部位。 乙 烯 根冠、萎蔫的叶片等 脱落酸 主要是根尖 细胞分裂素 未成熟的种子、幼根、幼芽 赤霉素 主要合成部位 种 类 1934年提取：吲哚乙酸（IAA） 苯乙酸（PAA） 吲哚丁酸（IBA） 具有生长素效应的还有： 燕麦胚芽鞘 Darwin的向光性实验 燕麦胚芽鞘去除顶端 燕麦胚芽鞘 加不透明帽子 燕麦胚芽鞘 加透明帽子 达尔文的推测： 单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某种刺激，当这种刺激传递到下部的伸长区时，会造成背光面比向光面生长快，因而出现向光性弯曲。 詹森实验证明： 胚芽鞘尖端产生的刺激物可以透过琼脂片。 拜尔实验证明： 弯曲生长是因为顶尖产生的刺激物分布不均匀造成的。 燕麦胚芽鞘 去除顶端，加琼脂块 燕麦胚芽鞘 去除顶端，加处理过的琼脂块 实验结论总结 生长素的产生部位： 生长素的作用部位 （胚芽鞘的生长部位） 胚芽鞘的感光部位： 胚芽鞘的尖端 胚芽鞘的尖端下段 胚芽鞘的尖端 单侧光使背光一侧比向光一侧生长素分布得多； 背光一侧的细胞纵向生长的快，结果使得茎朝向生长慢的一侧弯曲。 生长素为什么能引起向光弯曲？ 生长素的产生部位 生长素的分布 生长素的运输方向 主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子。 大多集中在生长旺 盛的部位。 从植物体形态学上端向形态学下端运输 。 根：背向根尖运输