第七章 蛋白质工程的应用 修改.pptVIP

抗原（antigen,Ag)是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性结合的物质 。 最常见的抗原分子是大分子蛋白质。 医学上重要的抗原 病原微生物：细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、放线菌、螺旋体、真菌。成分复杂，不同抗原成分组成的复合体。 细菌外毒素与类毒素 外毒素：某些细菌在生长过程中合成分泌到菌体外的毒性物质。肉毒毒素 1mg 可杀死 2亿只小鼠。 类毒素：外毒素经 0.3％～0.4％甲醛溶液处理后，失去毒性，仍保留免疫原性。 异种动物血清：抗毒素的抗体，可中和病人体内相应毒素，同时是异种抗原。 肿瘤抗原：细胞恶变过程中出现的新抗原的总称。 抗体的发现 1890 年，德国学者 Emil von Behring在 Koch 研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。Behring于 1891 年应用来自动物的免疫血清成功治疗了一个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病例。为此，他于 1902 年获得了诺贝尔医学奖。 第一节 抗体工程 抗体工程（antibody engineering）是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。 二、抗体的结构与分类 （一）抗体的结构 1．重链和轻链 重链（heavy chain，H链）由450-550个氨基酸组成，分子质量约为50-70 ku，有4-5对链内二硫键。 轻链（light chain，L链）由214个氨基酸组成，分子质量约为2.5 ku，有两对链内二硫键。 2．可变区和恒定区 （二）抗体的分类 多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体 1.多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb)  6-8aa 2.单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb, mAb) 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。 B淋巴细胞杂交瘤技术 该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb的杂交瘤细胞。 细胞融合 细胞融合（Cell fusion）是上世纪60年代发展起来的一门细胞工程技术，在自然条件下或人工诱导使两个或两个以上的相同或不同的细胞合并形成一个细胞的过程。 细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞挨近，两者细胞膜粘合，以后膜组织局部破损，最终形成完整的连续胞膜。 融合剂 细胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，故均须添加具有诱导细胞融合效应的生物因子或化学试剂，或采用电融合技术，人为地促进细胞融合。 通常把这种可以促进细胞融合，提高细胞融合率而加入的生物因子或化学试剂叫做细胞融合剂。 HAT选择杂交瘤细胞 细胞融合是一个随机的物理过程，并非全部的细胞都能融合。除不同亲本细胞间的融合外，与此同时还伴有各亲本细胞的自身融合，就需设法把含两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。 最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本细胞死亡，仅让杂种细胞存活下来。 随机融合后的细胞类型 抗体的检测 细胞融合2周左右就可筛选杂交瘤细胞，即是有针对性地从众多的细胞孔中选出分泌所需抗体的杂交瘤孔。 3.基因工程抗体 基因工程抗体是利用DNA重组技术，通过对抗体基因结构与功能的了解,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接、或修饰，或直接合成抗体基因序列，再将基因导入细胞表达产生的一类抗体。 人鼠嵌合抗体 在基因水平上将鼠源单克隆抗体的可变区和人抗体的恒定区连接起来，并在合适的宿主细胞中进行表达的抗体。 鼠单抗可变区人源化抗体 改形抗体 将人单抗的CDR区替换成鼠单抗的相应区域，就能使得人单抗获得与鼠单抗一样的抗原特异性，并最大程度的降低抗体异源性。 镶面抗体 使骨架区中暴露的氨基酸残基替换成人单抗可变区的相应的氨基酸残基就可使鼠单抗可变区人源化。 ScFv的结构 特点 ScFv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段, 由重链可变区和轻链可变区构成的小分子,它仍然保持着天然抗体的特异性和大致相似亲和力。重链可变区和轻链可变区由一条亲水性的柔软的连接肽。 从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。 scFv 的特点 1. 分子小:全抗体的1/6 2. 免疫原性低 3. 非靶向组织中滞留时间短 4. 在血液中清除快 5. 对肿瘤穿