二花脸和大后白猪排卵前卵泡差异表达的mir-331的功能初步研究.docxVIP

二花脸和大白猪排卵前卵泡差异表达的miR．331·的功能初步研究目 二花脸和大白猪排卵前卵泡差异表达的miR．331·的功能初步研究 目 录 摘要 i Abstract ·· - iii 中英文缩写对照表 ·v 第一章文献综述 1 l前言1日U舌 ·11。 2 miRNA的研究进展 ·2 2．1 miRNA的发现与命名 “2 2．2 miRNA的分子结构特点 ”2 2．3 miRNA的产生过程及调节机制 ”2 2．4 miRNA在卵巢中的作用 ．．4 2．4．1 miRNA对卵巢发育及卵母细胞成熟的影响 4 2．4．2 miRNA在卵泡发育中的作用 4 2．4．3 miRNA调节黄体的形成 6 3线粒体基因 。7 3．1线粒体结构 “7 3．2线粒体基因 ．．8 3．3 CYTB基因的功能 ·9 4目的与意义 lO 第二章材料与方法 11 1实验材料 1l 1．1菌株 1l 1．2细胞系 1l 1．3载体 一1 1 1．4主要仪器和设备 12 1．5主要试剂与试剂盒 13 1．6常用试剂及配制 14 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文1．7生物信息学网站及分析软件 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 1．7生物信息学网站及分析软件 “14 2试验方法 l 5 2．1双荧光素酶报告载体的构建 ·15 2．1．1插入片段的扩增 ～15 2．1．2 PCR扩增产物的检测和回收 16 2．1．3克隆载体的构建及酶切回收 一16 2．1．4重组表达质粒的构建 ．．1 8 2．2 CYTB突变型双荧光载体的构建 20 2．3细胞培养 ．21 2．3．1细胞复苏 ．．2l 2．3．2细胞培养和传代 ．．2l 2．3．3细胞冻存 一2l 2．3．4细胞转染 ．．22 2．4双荧光素酶相对活性的检测 ．22 2．4．1细胞裂解 ．．22 2．4．2双荧光素酶活性的检测及计算 ．．23 2．5细胞总RNA的提取 ．．23 2．6 Q．PCR分析 ．24 2．6．1 miRNA的定量分析 ．24 2．6．2基因的定量分析 ．．26 2．7 Western Blot验证 27 2．7．1细胞总蛋白的提取 ．．27 2．7．2蛋白浓度测定 ．．27 2．7．3 SDS—PAGE凝胶电泳 28 2．7．4 ECL化学发光检测 29 2．8细胞增殖 ．29 2．8．1细胞悬液准备 ．．29 2．8．2 E—Plate 96准备 ．29 2．9细胞凋亡 ．30 Ⅱ 万方数据 二花脸和大白猪排卵前卵泡差异表达的miR．331的功能初步研究2．10检测细胞ATP 二花脸和大白猪排卵前卵泡差异表达的miR．331的功能初步研究 2．10检测细胞ATP ．．31 2．10．1标本的采集与保存 3l 2．10．2操作步骤 32 2．11流式细胞仪细胞周期测定 ．．33 第三章结果与分析 34 1 miR-331*靶基因的生物信息学预测与候选靶基因的选择 34 2 miR．331与其靶基因CYTB靶向关系的验证 34 2．1miR．331枣与其靶基因CYTB的结合位点 ··34 2．2双荧光素酶报告载体的构建与验证 35 2．2．1靶基因的扩增 ··35 2．2．2重组载体的鉴定 ”35 2．2．3 CYTB突变型双荧光载体的构建 36 2．2．4 miR-33 1*结合位点的验证 ”36 2．3实时定量的结果 38 2．3．1细胞总RNA提取结果的检测 38 2．3．2实时定量PCR检测靶基因CYTB的mRNA的水平 38 2．4 Western Blotting分析 ·39 3 miR-331*及其靶基因CYTB的功能研究 ·39 3．1靶基因CYTB干扰片段的构建 ·39 3．2细胞增殖 40 3．3细胞凋亡 41 3．4相关凋亡蛋白质的表达水平检测 42 3．5细胞周期检测 43 3．6细胞周期相关蛋白的检测 45 3．7细胞中ATP含量的检测 46 3．8 miR-331及其靶基因CYTB对ERK通路的影响 47 3．9 miR-33 l木及其靶基因CYTB对DNA损伤的影响 48 第四章讨论 49 1关于miR-331半及其靶基因CYTB的靶向关系 ··49 HI 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2关于细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2关于细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期 49 3关于细胞内ATP的含量 50 4关于ERK通路 ．．51 5关于DNA损伤 ．52 6 miR-33 1木及其靶基因CYTB与繁殖性能差异的联系 ．52 7下一步的工作计划 53 小结 54 参考文献 55 致谢 6l IV 万方数据 二