棉酚诱导的棉铃虫P450GIP的分离鉴定和功能研究.doc

PAGE —PAGE 1— 附件2 论文中英文摘要 作者姓名：毛颖波 论文题目：棉酚诱导的棉铃虫P450 GIP的分离鉴定和功能研究 作者简介：毛颖波，女，1975年09月出生，2000年09月师从于中国科学院上海生科院植物生理生态所陈晓亚研究员，于2008年03月获博士学位。 中 文 摘 要 植物和昆虫在长期的协同进化过程中，越来越多样化和复杂化。植物为昆虫提供了栖息场所和食物，许多昆虫则在取食过程中为植物传粉，成为这些植物家族繁衍不可或缺的成员。但是，许多植食性昆虫严重影响植物生长。植物在被昆虫取食时，合成并积累大量的对植食性昆虫有毒的次生代谢物质，昆虫则在长期协同进化过程中发展了一系列适应机制来克服植物的防御反应。例如，植食性昆虫具有非常发达的解毒酶系，其中P450单加氧酶是重要成员，对昆虫克服植物次生代谢产物以及杀虫剂的毒性至关重要。 RNA干扰（RNAi）是一种新发现的基因调控机制，是指一些双链RNA（dsRNA）经加工形成21-25bp左右的小分子干扰RNA（siRNA），它通过DNA甲基化，mRNA降解或阻断蛋白质翻译，高效、特异地阻断体内特定基因的表达。人们从植物的基因表达共抑制和真菌的抑菌作用现象发现了RNA干扰这一古老的生物体基因调控机制，在植物中RNA干扰参与抗逆和抗病等反应。目前，RNA干扰已被发展成为一种成熟的技术被广泛应用于基因功能研究和基因专一治疗。 在研究棉酚与棉花抗虫过程中，开发了一种利用RNA 干扰机制、以植物作为载体来抑制昆虫生长的方法。即：将包含正向和反向昆虫基因(或片段)序列导入到植物内，在植物中表达昆虫基因的dsRNA，当昆虫在取食了转基因植物后，体内的靶基因通过RNA干扰途径被抑制，从而使害虫的生长发育受到抑制。 棉酚等倍半萜醛类是存在于棉花组织中的次生代谢化合物，具有抑制植物病原菌生长以及抵御昆虫侵袭的作用，对许多生物包括昆虫具有一定的毒性。棉铃虫（Helicoverpa armigera）是最重要的农业害虫之一，不仅对棉花生产造成严重影响，还危害十字花科、豆科、茄科甚至禾本科植物。尽管棉酚在一定条件下对棉铃虫的生长发育有一定影响，但经过长期进化，棉酚含量正常的棉花对棉铃虫取食几乎没有影响，甚至具有助食作用，这说明棉铃虫有一套有效的棉酚解毒体系。如果利用RNA干扰破坏这种解毒机制，棉酚对棉铃虫的抑制作用将大大增强。利用棉铃虫 (H. armigera) cDNA文库，分离到了一个与棉酚耐受性相关的P450基因GIP (CYP6AE14)。CYP6AE14在棉铃虫中肠高表达，能被棉酚专一诱导。当食物中存在棉酚时，其表达水平与棉铃虫的生长呈正相关。为抑制CYP6AE14的表达，进一步设计了特异的基因载体，转入植物后，在植物组织中产生了与CYP6AE14相匹配的dsRNA和小分子干扰RNA。当棉铃虫幼虫进食了这些转基因植物后，内源CYP6AE14基因的表达显著降低。将生长在dsRNA转基因植物上的幼虫分别转移至含1mg/g棉酚或1 mg/g单宁的人工饲料上生长，两天后发现来自喂食dsRNA转基因植物的棉铃虫对棉酚的耐受性大大减弱。同样，用有酚棉的叶片喂食这些棉铃虫时，幼虫生长缓慢或停止生长，发育受到抑制。 为了证明植物介导的RNA抑制对CYP6AE14的作用是否可应用于其他的棉铃虫中肠基因，一个由EST测序得到的棉铃虫中肠高表达的基因，GST1，编码谷胱甘肽-S-转移酶被用来考察其是否也存在植物介导的RNAi调控。用同样的方法构建了dsGST1载体，将其转入到拟南芥中。选择其中一个表达量较高的株系（AtdsGST1-5）进行了棉铃虫饲喂实验。Northern检测发现在进食AtdsGST1的棉铃虫中肠内的GST1转录水平明显降低。对这一实验进行多次重复，都得到了类似结果。由于GST1在中肠有较高的表达，因此认为当GST1表达受到植物介导的RNA抑制后，可能会引起中肠GST活性的降低。将三龄进食AtdsGFP和AtdsGST1植物四天后的棉铃虫幼虫被解剖后，取中肠总蛋白，以二硝基苯酚为底物测试了中肠总蛋白中GST的酶活，证实进食AtdsGST1的棉铃虫其中肠内的GST活性明显低于进食AtdsGFP植物的棉铃虫。以上结果表明，在植食性昆虫中，植物体内的dsRNA通过昆虫取食进入到昆虫体内并干扰昆虫靶基因的表达具有普遍性。 植物介导的昆虫RNA干扰的一个显著优点是通过昆虫直接取食植物来干扰昆虫体内靶基因的表达，这比目前常用的注射dsRNA简便得多，使RNA干扰抗虫植物在农业生产中的应用成为可能。目前常用的Bt转基因抗虫作物，Bt蛋白毒性大，选择性小，并且已在大田发现了抗Bt毒蛋白的农业害虫。植物介导的昆虫RNA干扰，由于可以根据昆虫特定基因的序列设计dsRNA，能够专一地，有选择地