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基因芯片的制造及其应用 夏咏梅 2008.11.03 基本概念回顾 基因芯片的制备技术 基因芯片的应用 1. 基本概念回顾 just for chemistry people 核酸包括DNA和RNA两大类。 DNA 核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。 嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、核苷酸和核酸进行定性和定量分析。 RNA的结构与功能 miRNA和siRNA的基本介绍及区别 siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1(RNAi缺陷基因-1)调控完成。只降解与其序列互补配对的mRNA。 MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 5′端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种 。 人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。 miRNA与siRNA的不同点 1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNAi的中间产物。 2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。 3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。 4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。 5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链核酸在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。其基本过程包括下列几个步骤。 （1）制备样品：首先从待检测组织提取DNA或RNA。 DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。 （2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。 （3）杂交：先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核