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经典基因敲除技术; 1.基因敲除载体 ;重组基因载体的构建;基因敲除中——同源重组原理;DSBR model;DSBR model;;1.3插入型载体（Insertional vector）;影响基因敲除效率的因素;载体的类型 ;选择置换型载体的原因;2.基因敲除载体导入ES细胞;2.1显微注射法;?显微注射法的优点：
?外源基因转移率高，整合效率较高。例如小鼠为6%-40%，猪和羊分别为0.98%和0.1%，而鱼类通常可达10%-75%。
?外源基因的长度不受限制，可导入250Kb左右的DNA片段。
?可直接用不含原核载体DNA片段的外源基因进行转移，而不需要加入选择性标记基因。
?显微注射法的缺点：
?技术难度大，昂贵的设备和非常熟练的技术
?一次只能转染一个细胞，无法获得大量的细胞用于筛选。;2.3电穿孔法;;3.筛选与鉴定 ;3.1正向筛选;无启动子筛选法;poly（A）缺失筛选;优点：
基因敲除载体的构建简单，富集效率高。
局限性：
只适用于在ES细胞中能较好表达的基因，否则即使发生同源重组，选择性标记基因的低水平也无法抵抗筛选药物的作用。基因敲除载体在构建完成以后，必须对其中的同源序列在内的所有元件进行研究，避免前在的表达调控因子的存在。; 3.2正负筛选;1;1; 3.3PCR筛选;neo;3.4PCR鉴定;3.5Southern 鉴定; 鉴定完成后得到的ES细胞经体外遗传修饰之后通过显微注射、胚胎聚合、核移植的方法入动物体胚胎。
获得的动物需要进一步的交配建立纯合的基因敲除动物模型。比较正常动物与基因敲除动物的表型差异，可以推测被敲除细胞的功能。;4.基因敲除的应用;4.1基因敲除与医药学; 4.1.2基因和蛋白功能研究方面的应用; ; 4.1.4治疗措施研究方面的应用; 基因敲除模型在免疫学、毒理学、基因治疗方面研究扮演重要作用。
Gerlai 等指出,目前基因敲除的结果忽略了背景基因的作用,由于敲除基因的缺失,动物机体可能产生一种雪崩式的代偿过程,引起基因的第二次改变,因此有理由相信一个复杂的表型改变与某一特定的基因不是完全一对一的因果关系。;
微生物基因功能鉴定; 4.2.3用于改进微生物代谢产物产量; 阿维菌素是迄今发现最有效的杀昆虫剂，杀螨虫剂???杀寄生虫剂之一。对其生物合成相关基因功能的研究，有利于生物合成途径的明确，这使得人们可阻断特定基因表达构建新型菌株，以增加有效组分及新型的抗生素的产出，还可通过化学修饰的方法来提高阿维菌素活性。;谢谢！！！
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