蛋白质酶核酸的分离纯化-作物学试验教学示范中心.ppt

第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化 第一节 引言 蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子； 蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能； 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。 一、分离纯化的意义 ①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义； ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂； 　（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等） ③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病； ④基因工程的需要。 二、分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。 三、分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理； ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）； ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 第二节 蛋白质（酶）、核酸 分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 二、细胞的破碎 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎； 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的； 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 三、细胞器的分离 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。 四、提取 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。 　?提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。 1、蛋白质（酶）的提取 大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。 对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。 2、核酸的提取 DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。 DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液。 RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到RNP。 　提取得到DNP或RNP后