细胞与遗传学实验设计.docx

细胞与遗传学实验设计13级临床医学八年制2班 赵钎 已知： A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； 心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 实验目的： 明确B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系； 明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 实验1：B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系研究 实验方法： 乳鼠心肌细胞原代培养。取出生1~3d大鼠1若干只，无菌条件下开胸取出心脏，放入4℃D-Hanks缓冲液清洗，在冰上，将心脏剪成1mm*1mm*1mm的组织块，用0.08%胰蛋白酶和0.1%胶原酶交替消化，消化时置于37℃水浴磁力搅拌器上，每次8min。消化完成后，将上层液体转至10ml离心管中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和，1000rpm离心5min，去上清，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，保存于37℃CO2培养箱。将心肌组织分次消化收集，最后将收集的细胞悬液用200目滤网过滤，将过滤后的细胞悬液置于培养皿中，于5%二氧化碳、37℃培养箱中贴壁2h。收集未贴壁的细胞悬液，计数细胞，调整至5~6*105每毫升，加入0.1mmol/LBrdU，吹打后接种于35mm培养皿（2ml/皿），接种后48h首次换液，继续加入0.1mmol/LBrdU，心肌细胞培养5d。 心肌细胞缺血模型建立。5d后，取12皿，弃去10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，每培养基加入2ml不含血清的DMEM无糖培养基，其中6皿加入B基因的抑制剂（Inhibitor）调整三气箱参数为0.5%氧气，5%二氧化碳，94.5%氮气，恒温37℃，1h稳定后，将细胞转入其中培养，分别在1h、2h、3h后取出2皿普通缺血和2皿加入抑制剂的，进行后续实验，是为1h普通缺血组，2h普通缺血组和3h普通缺血组以及1h抑制剂缺血组，2h抑制剂缺血组和3h抑制剂缺血组。未缺血培养的取4皿，2皿正常培养，2皿加入抑制剂，为空白对照组和抑制剂对照组。（见下表） 组别 空白对照 抑制剂对照 1h缺血 2h缺血 3h缺血 1h缺血+抑制剂 2h缺血+抑制剂 3h缺血+抑制剂 缺血 - - + + + + + + 抑制剂 - + - - - + + + 免疫组化方法测定B蛋白表达量。上述各组细胞每组各取1皿，吸弃培养液，PBS洗3次，甲醇固定5min，PBS洗3次，加入封闭液，37 ℃，30-60min，吸去上清液；加一抗，37 ℃恒温1-2h后置4℃冰箱过夜。第二天取出，PBS洗3次；加二抗，37 ℃恒温1-2h后，PBS洗3次，加0.3％ H2O2-PBS，37 ℃，30min；PBS洗3次；加SABC工作液，37 ℃，30min；PBS洗3次；DAB显色，镜下控制，以蒸馏水终止反应后观察结果。 CCK-8法测细胞活力。每组取剩余的一皿，吸弃原培养液，加 CCK-8 工作液，继续培养，待CCK-8 作用1h，在450nm波长处比色，测定吸光度，分析各皿心肌细胞活力。 实验结果分析： 通过比较模拟缺血时间不同组别之间细胞活力和B蛋白表达量的关系，定性地指出B蛋白与心肌细胞缺血的关系，如正相关或负相关。还可通过软件分析免疫组化方法测得的B蛋白表达量的相对多少（根据色差），用假设检验，明确B蛋白和心肌细胞缺血时间和细胞活力的关系，并给出P值。尤其关注B基因被抑制后，心肌细胞缺血损伤的发展。（1）若B基因的表达量随缺血时间延长，细胞活力下降而相对增加，在B基因抑制后心肌细胞缺血损伤加速发展，可认为B蛋白参与抗心肌细胞缺血损伤。（2）若B蛋白表达量随缺血时间延长而相对增加，但B基因被抑制后，缺血损伤未加速发展反而滞缓，说明B蛋白可能在损伤发生后促进细胞凋亡，此时可以测定培养液中LDH的量判断细胞是否发生了坏死和坏死的多少。（3）若B蛋白表达量随缺血时间延长而下降，则认为可能是因心肌细胞缺血损伤表达量下降，可能意味着B蛋白参与未损伤时的正常生命活动，在损伤后，该正常活动被破坏。 实验2：A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 1，药物组和对照组设立。取实验1中原代培养乳鼠心肌细胞10皿，8皿依照实验1的方法进行心肌缺血模拟（缺血2h），除此以外，施以如下干预： 组别 对照组 药物组 药物+抑制组 抑制组 A药物 - + + - 抑制剂 - - + + 每组2皿。 2，依照实验1中的方法对细胞进行免疫组化测定B蛋白表达量和细胞活力测定。同时，若A药物有已知的biomarker判断是否起效或效果如何，则以该标志为准。 实验结果分析：同实验1，可以定性分析A药物和B基因的关系，（1）若药物组心肌细胞缺血损伤缓解，抑制组损伤加剧，药物+抑制组损伤介于二者之间则说明B蛋白可能参与A药物