手工碱裂解法抽提质粒试剂溶液I.pptVIP

能自主复制； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 质粒的复制型 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 严谨型(Stringent control) ：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒 松弛型(Relaxed control) ：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　RNA 实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。 在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。 当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀质粒DNA。 手工碱裂解法抽提质粒 试剂： 溶液I ：50mM 葡萄糖， 25mMTris·HCl（pH8.0），10mM EDTA 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II： 0.2N NaOH， 1%SDS（新鲜配制） 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III： 5M KAC 　 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀， K＋可中和DNA 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 实验仪器与材料 （一）仪器：超净工作台，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅 （二）材料：1.5ml 离心管，加样枪，含有质粒pQE30的大肠杆菌TG1 、LB液体培养基 DNA的保存 1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： 置于TE缓冲液中-70℃可保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 离心的注意事项 1. 重量相等 离心管或试管需平衡（称重） 2. 位置对称 平衡好的离心管或试管需对称放置 * 实验一 质粒DNA的提取 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 载体的选择标准 质粒 DNA 的分离和纯化 质粒提取的主要步骤： 细菌的培养 细菌的收集和裂解 碱裂解法抽提质粒 1. 手工碱裂解法抽提质粒 2. 质粒提取试剂盒(离心柱型) ☆原理示意图 　碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液（含DNA) 酚抽提(去蛋白） 洗涤沉淀 乙醇沉淀DNA TE溶解DNA 质粒DNA溶液 平衡液BL STE缓冲液（溶液P1） Lysis Buffer（溶液P2） 3M NaAc，pH 4.8（溶液P3） 去蛋白液PD 漂洗液PW 洗脱缓冲液EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （10mg/ml） [质粒提取试剂盒组成] 使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。 2. 漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。 3. 使用前先检查平衡液BL、溶液P2 和P3 是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 [实验准备] 实验步骤 1. 细菌培养：接种含质粒pQE30的大肠杆菌TG1 10μl 到10ml含氨苄青霉素(100μg /ml)的LB培养液中， 37℃摇培过夜（10~12h） 2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 10000 rpm，1min 倒掉收集管中的废液