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实验五 酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、目的 掌握ELISA的操作方法 了解ELISA在动物疫病诊断的意义 二、材料 酶标条、猪链球菌9型抗原、待测血清、阴性血清、碳酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、加样器等 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。 ELISA检测抗体 Ag + Ab1 ? Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ? Ag-Ab1-Ab2* ELISA检测抗体 Ab + Ag* ? Ab-Ag* ELISA检测抗原 Ag + Ab* ? Ag-Ab* 三、操作步骤 包被抗原 抗原用包被液稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜或37 ℃ 2h，洗涤液（PBST）洗涤1遍 (200μl/孔)，泡洗3min，甩干孔中液体 洗涤液（PBST）：PBS 1L，Tween-20 0.5ml，调PH 至7.4 包被用缓冲液 pH9.6碳酸盐缓冲液 (Na2CO3 1.5g，KCl 0.2g，NaHCO32.9g，加双蒸水至1L ) pH7.2的磷酸盐缓冲液 包被蛋白用PBS稀释至浓度范围1μg/ml-50μg/ml(可溶性抗原浓度通常在1-10μg/ml)，可设不同抗体稀释度来确定最佳使用量 如果包被的是细菌，则选择OD600为0.6左右，用包被液洗涤两次，超声裂解（工作5s，间隔10s，总共80次），之后可进行包被 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附 封闭液（含2%BSA的PBST）,200μl/孔，37℃，2h后弃去封闭液，经PBST洗涤一次拍干后可现用，也可在－20℃保存2－3个月 加入一抗 加入待测样品：血清样品1：100开始倍比稀释，加入酶标反应孔中，每样品加双孔，每孔100微升， 37℃孵育1h ，PBST洗三遍（每孔200微升），每次3min，拍干； 加入二抗 加入特定的抗抗体 二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：5000-10000， 37℃孵育1h ，PBST洗三遍（每孔200微升），每次3min，拍干； 显色 HRP的两种底物： OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物 TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定。最适吸收波长为450nm。 AP的底物： 磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。 产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为2mol/L硫酸 AP的终止液用NaOH 结果判定 加入底物液（TMB）：每孔加入100微升，室温下放置10 min 终止反应：每孔加入终止液 50微升 测定OD450：终止反应后30分钟内用酶标仪测定450nm波长的光密度值 结果判定：用测定样品孔的吸收值与阴性标本测定孔平均吸收值的比值（P/N）表示，当P/N大于2.1时，判定为阳性 作业 实验报告 ELISA的原理 ELISA的意义 * * 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种： *