动物细胞培养和表达制备药用蛋白我课件.ppt

第十一章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白 主要内容 动物细胞培养概念与特点 体外培养细胞生长和增殖过程 动物细胞小规模培养 动物细胞大规模培养 动物细胞表达制备药用蛋白 第一节 动物细胞培养概念与历史 定义： 动物细胞培养是指将动物的体内组织取出，使其分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在体外一定的条件下(无菌、适当温度和一定的营养条件下)，使之存活、生长和增殖的技术。 动物细胞培养是动物细胞工程的重要技术基础：细胞 融合、单克隆抗体与杂交瘤技术、胚胎工程、干细胞 工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等 等都离不开～。 原代培养与传代培养 在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为原代培养或称初代培养(primary culture)和传代培养，传代培养又称继代培养(secondary culture)。 原代培养与传代培养 原代培养是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一培养过程。 原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组织或称为组织块(tissue block)进行培养，另一种是将机体组织分散后制成单细胞进行培养（组织消化法）。 原代培养 组织块原代培养 原代培养 原代培养 原代培养 组织消化原代培养 在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶的粗制品等。这些酶既可单独使用，又可联合使用。因为粗制品常混杂有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，而精制品更具特异性，并且毒性小。 原代培养 原代培养注意事项 虽然各种细胞培养需要满足不同的条件，但有几种条件是大多数原代培养共同需要的：①在取材时需去除脂肪和坏死的组织；②为减小对组织的损伤，需用锋利的器具；③适度离心以去除用于解离的酶；④由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度；⑤营养丰富的培养基比单一的培养基(如，Eagle's　MEM)更可取；⑥胚胎组织在原代培养中更易分离，细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组织更可取。 随着原代培养物培养时间的延长、细胞分裂增殖的进行，培养物体积或密度会越来越大，一方面可能会长满培养空间，另一方面分裂增殖的细胞会互相接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止。 传代培养 将细胞培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代培养(passage culture)。 原则上，传代是以原代培养物贴壁生长长满培养器皿的生长面或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，但传代的具体时间并没有固定的时间，操作者可以根据具体情况安排传代时间。但是，提前或推后传代都不可取，尤其是后者。 发展历史 1、动物细胞（组织）培养技术的起源： 动物细胞培养的奠基人：美国生物学家哈里森（1907年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细胞突起的生长过程。 先驱者法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自1923年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使多种动物组织培养获得成功。 2、20世纪40年代以后： 动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养基 方面。 3、20世纪80年代以后： 随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展， 已能把特定的外源基因通过PCR技术扩增几千倍，并 可转染到细胞内，使其得到高质量的表达。 4、近年： 淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了一个 新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大量繁殖并产 生单克隆抗体。 随着基因重组和单克隆抗体技术的发 展，动物细胞培养展现出越来越可观的工业化前景。 第二节 动物细胞培养的特点 （一）动物细胞之间的连接特点： 1.紧密连接：牢固、无间隙。（封闭连接） 2.间隙连接：2-3nm间隙。 （通讯连接） 3.桥粒连接：有间隙，有纤维形成的特殊结构（锚定连接） 动物细胞培养的特点 （二）动物细胞的培养特点： 1.动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 2.动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易污染。 3.培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 4.动物细胞间主要以聚集体形式存在。 5.原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。 6.动物细胞对于营养条件更加苛刻，除一般的营养物 质外，还需要血清。 7.适应性差, 对于培养环境很敏感，如pH，溶解氧， 温度，剪切力等。 8.绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的 表面才能生长。 辨析： 概念 动物组织培养(tissue cul