配方粉和原料中的牛乳铁蛋白的定量测定.pptVIP

BioLynx软件分析牛乳铁蛋白理论酶切片段 奶粉样品用 0.02% PPS 500 mM NH4HCO3溶液溶解 样品处理过程 加入 DTT，终浓度 5 mM, 50 ℃,30 min 后 冷至室温 还 原 加 IAA 终浓度15 mM,黑暗中静置 30 min 烷基化 加CaCl2浓度1 mM, 加胰蛋白酶 (酶:蛋白＝1:20)37 ℃,4-6个小时处理 酶 解 加盐酸，室温静置60 min后，加水， 所得样品酶解液离心过滤、待测 终止酶解 DTT加入量实验 酶浓度与酶解时间 牛乳铁蛋白稳定同位素标记特异肽的全扫描和子离子扫描 全扫描 子离子扫描 牛乳铁蛋白与同位素标记内标肽的线性和酶解效率 牛乳铁蛋白特异肽与同位素标记特异肽相互干扰 牛乳铁蛋白特异肽 同位素标记特异肽 加标样品酶解前后的色谱质谱图 方法学验证 基质 测定值(mg/100g) 回收率(%) 平均值(%) RSD(%) 鲜牛乳本底值 15.3±0.02 鲜牛乳加标 10mg/100g 24.35 90.5 92.1　 1.5 24.64 93.4 24.57 92.7 24.47 91.7 24.37 90.7 24.68 93.8 配方粉本底值 55.1±0.05 配方粉加标 30mg/100g　 83.21 93.7 94.7　 1.3 83.84 95.8 83.15 93.5 84.05 96.5 83.51 94.7 83.24 93.8 配方粉加标 100mg/100g 　 152.9 97.8 98.6　 0.7 154.4 99.3 153.2 98.1 153 97.9 153.9 98.8 154.6 99.5 三种方法比对 ELISA 法 HPLC 法 LC-MS/MS 法 相同5个样品 过肝素柱后两种方法的比对 实验一(HPLC) ： 样品溶解用肝素亲合柱处理，洗脱液直接HPLC检测。 实验二(HP-LC/MS) ： 吸取一定量的肝素柱处理洗脱液，按酶解法处理，LC-MS/MS检测。 方法比对 取6份新鲜乳(未经任何处理的生鲜牛奶)，分别按照肝素柱-HPLC 法及本研究方法进行处理，计算结果。 方法比对 热变性实验： 准确吸取1mL 200 μ g/mL 的标准溶液于EP 管中，分别于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90℃下恒温水浴1h，取部分上HPLC测定，取另一部分按本研究方法进行酶解处理后，LC-MS/MS测定。 讨 论 本研究方法相比于液相法或ELISA法，操作简便、选择性好、灵敏度高、重现性好，适用性较广。 对于配方奶粉的结果，本研究方法明显高于其他两法，原因在于本方法可同时测定样品中的非变性乳铁蛋白及因喷雾干燥而热变性的乳铁蛋白，而HPLC法及ELISA法只可测定样品中非变性部分的乳铁蛋白。 对于未经加热的样品，本研究方法与HPLC法的测定结果吻合度较好。 各种实际样品检测 样品：生鲜乳 样品：配方粉 样品：全脂奶粉 样品：脱脂奶粉 样品：乳铁蛋白原料 展望 1. 本方法依据蛋白组学分析的理念与数据库，引入酶切、色谱与串联质谱相技术，运用同位素标记内标法定量，方法灵敏度高、准确度优，选择性好，成功地运用到乳制品中牛乳铁蛋白含量的检测，为原料的质量提供检测技术保障；同时也能很好地适用于不同含量原料中牛乳铁蛋白的检测，为原料与产品的质控和开发提供技术支持。 2. 应用已建立的蛋白质定量平台，对母乳或婴幼儿食品中的营养与功能性蛋白质。比如乳清蛋白的主要组成：乳球蛋白，血清白蛋白和糖巨肽。乳铁蛋白、免疫球蛋白、成骨蛋白等营养和功能性微量蛋白质的定量检测方法做进一步的应用研究； 3. 进一步利用此平台，对众多婴幼儿食品中的过敏原物质（蛋白质、肽）的定量检测方法进行研究，如麦醇溶蛋白(Gliadin)、麸朊(Gluten)、各类酪蛋白、花生蛋白、大豆蛋白、木瓜蛋白和胡桃蛋白等。 4. 利用此平台，尝试对致病性微生物的毒性蛋白的定性与定量分析：金黄色葡萄球菌肠毒素 A,B 和 C1型肽类，还可对疫苗有效蛋白的研究 … 测定所用的试剂盒 其他牛蛋白质的定量分析 β-乳球蛋白（β-lactoglobulin)是鲜奶当中乳清蛋白的一种，约占鲜奶蛋白质的7~12%。 有多种遗传变异体(A、B和C)，最主要为A和B。目前，变异体C仅在泽西牛(Jersey cows)中发现。 β-乳球蛋白结构 牛β-乳球蛋白特异肽 牛β-乳球同位素特异肽 牛酪蛋白的定量检测 一个α-乳白蛋白应用实例 原料2（实际货）：标示90%，实测:27% 原料1（展示样）：标示90%，实测:92% 山羊奶与牛奶的β- 酪蛋白区别 样品：山羊奶 样品：牛奶 虽然牛奶会在山羊奶通道里出峰，但是保留时间不同 虽然牛与山羊奶b