抗肝损伤与肝纤维化药实验法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 【操作步骤】 （ 1）动物及手术：大鼠，200~250g。ip戊巴比妥钠50mg/kg，腹腔U型剪开，将腹腔内脏器移向大鼠左侧，即可见胆管及肝门静脉；先插入胆管导管，并固定；然后在门静脉近肝端与幽门静脉分支之间穿入一手术丝线，打一活套，然后插入门静脉插管，迅速固定，立即开始灌流，打开上、下腔静脉，冲去肝内残血；将肝完整无损地分离出来，置灌流仪中灌流。 双向灌流需在插入门静脉插管灌流后，结扎下腔静脉，打开胸腔，由上腔静脉插入另一套管，再分离出整个肝。 2）脏器灌流：将肝移到灌流仪的脏器托盘上，先用灌流液冲洗肝内残存血液。调整灌流速度，检查流出液速度，保持灌流液能通畅流出。 【注意事项与评价】 （1）手术过程要迅速、仔细，保持肝被膜完整，尽量不要污染肝。整个手术要求在10~15min内完成，门静脉插管时，断血时间不超过1~2min。 （2）在大鼠离体肝灌流中，各项条件一经选定便应保持恒定，以维持肝的稳定活力。一般灌流温度为37℃，灌流液PO2至少45mmHg，灌流速度视不同灌流介质而不同。 第6节大鼠肝细胞原代培养实验方法 【基本原理】大鼠肝细胞分离方法是在肝离体灌流技术中引进胶原酶，藉胶原酶消化肝细胞间组织而达到分散肝细胞的目的。然后再经分离纯化而得到所需用的肝细胞或非实质细胞，进行原代培养。 【操作步骤】 (1)肝细胞的分散：先用无钙灌流液作预灌流，冲去残血，除去或减少肝细胞间的钙离子，以减少细胞间的粘着力。然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流，以消化细胞间质而分散肝细胞。 1)动物手术： 大鼠麻醉，背位固定。剥去腹部皮肤，75％酒精消毒腹膜，无菌剪开，内脏移至左侧，暴露肝门静脉和下腔静脉。离肝入口1-1.5cm处将肝门静脉以及下腔静脉与周围组织分离开，各穿一根手术棉线，打一活套备用。 并经下腔静脉注射0.06％肝素钠生理盐水溶液0.5～0.6ml。将静脉插管沿已分离的肝门静脉插入，使针头前端达左右肝静脉分支交汇处，迅速结扎棉线，固定门静脉插管。立即开始灌流。 2)预灌流：经无菌过滤，37℃和混合气体(95％02，5％C02)饱和的无钙灌流液灌流，剪断下腔静脉。灌流速度从慢至快，最后保持在40～50ml／min。打开胸腔，前腔静脉管处系一棉线，从右心房处插管至前腔静脉处，然后扎紧手术丝线，以防针管脱落。随之将后腔静脉处的棉线扎紧，迫使灌注液改由前腔静脉插管处流出。先作在位灌流数分钟，然后边灌流边切断肝与周围组织的联系，将肝移置肝托盘内继续灌流。不要损伤肝包膜。灌流液约500ml。 3)酶灌流：换用37℃的通人02的胶原酶灌流液。胶原酶的浓度一般约为0.05％左右。pH7.5，含钙而不含镁，含有机缓冲剂(如HEPES)。灌流速度仍维持40～50ml／min。胶原酶价贵，可设计循环灌流装置以节省用酶量。如果灌流通畅，则肝颜色均匀。 由于肝细胞间质被消化，灌流液进入细胞间隙，因而可见到肝逐渐肿胀。可根据经验，肉眼观察肝肿胀程度来选择最佳灌流时间。 一般酶灌流约需8～15min。 4)分散肝细胞：取下肝，将之移至盛有适当培养液(DMEM)的平皿中，撕去肝包膜后，轻轻振摇肝，肝细胞即可散落于培养液中而成肝细胞悬液。 (2)肝细胞的纯化 1)肝细胞的纯化：在锥形瓶肝细胞悬液37℃振荡培养15min。细胞碎片、库普弗细胞等则为由损伤细胞排出的粘性物质粘结成小块，可过滤时除去；完整的肝实质细胞则从外形不规则渐变为圆形，因而更加分散，也更易于通过滤网。 振荡培养结束后立即将锥瓶置冰水中冷却，用双层尼龙网(200目)过滤。滤液4C。200r／min离心3-5min，弃-上清，同上离心三次，培养液重悬，得到绝大部分为肝细胞悬液。 (4)肝细胞的培养： 作短时间培养的实验可将适当稀释的肝细胞于合适的小试管内作振荡培养。 如需作较长时培养，则要选用大小合适的培养皿加入适量的肝细胞，于C02培养箱内(5%C02与95％空气)进行单层细胞培养。如采用经过处理的塑料培养皿，则约经1.5-2h培养细胞即可贴壁；如采用未经处理的玻璃培养皿，则需经8h左右肝细胞方能完全贴壁。 【注意事项】 (1) 灌流过程中如果肝颜色不均匀或出现花斑，即表明灌流不畅。灌流不畅时不仅细胞问质消化不够，减少分散的细胞产量，而且分散所得细胞的活率和功能也差。缺氧/压力增高都会使肝细胞损伤。 灌流不畅的可能原因有：①肝位置不佳致血管扭曲；②插管插入过深，或插管尖头的斜面过长，堵塞了门脉血管的分支；③灌流液中存在小颗粒物质或微小气泡而堵塞小血管；④麻醉过深或手术时间过长，或麻醉前动物过度紧张、应激反应等儿茶酚胺类分泌过多等因素使血