H1N1亚型猪流感病毒荧光RTPCR检测方法.pdfVIP

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2019-07-31 发布于北京
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ICS 11.220 B 41 DB21 宁省地方标准 DB 21/T 2469 2015 H1N1 亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Method of fluorescent RT-PCR for the detection of H 1N1 swine influenza virus 2015 - 04 - 30 发布 2015 - 06 - 30 实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/T 2469 2015 前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：关淼、曹东、兰德松、魏澍、赵凤菊、陈瑶、姚伟、刘坤洋、张雷、杨国丽、魏园园 I DB21/T 2469 2015 H1N1 亚型猪流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 1 范围本标准规定了H1N1亚型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）荧光RT-PCR检测方法的范围、器材和试剂、物和探针、操作步骤、结果判定和废弃物处理。本标准适用于H1N1亚型猪流感的诊断、监测以及流行病学调查，适用于猪鼻咽棉拭子、肺脏及肺脏淋巴结、鸡胚尿囊培养液以及细胞培养物中H1N1亚型SIV HA和NA基因的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。 2 规范性引用文件下列文件对于文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仅所注日期的版适用于文件。凡是不注日期的用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于文件。兽医实验室生物安全技术管理规范病原微生物实验室生物安全环境管理办法 GB/T 27521-2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 GB/T 27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 3 缩略语本标准及下述缩略语。 SIV：猪流感病毒（swine influenza virus）荧光RT-PCR ：荧光反转录聚合酶链式反应（real time fluozescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary DNA） HA：血凝素（Hemagglutinin） NA：神经氨酸酶（Neuraminidase） PBS：磷酸缓冲液（配方见附录A）（phosphate buffer solution） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） 4 原理 SIV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据H1N1亚型SIV保守基因序列设计一对特异性物以及一个TaqMan探针，在酶催化下，以母链DNA为模板，体外复制出与母链模板 DNA互补的子链DNA。Taqman