基因工程讲义课件.ppt

十、基因工程的应用 （一）基因工程制药 1、概述：利用基因工程技术研制和生产的药物 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就就是用于生物治疗的新型生物药物的研制 第一个基因重组产品，也是第一个基因工程药物——人胰岛素于1982年在美国问世 我国第一个基因工程药物干扰素-α1b 于1989年上市 2、基因工程药物 激素和多肽类：缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病，如人胰岛素、人生长激素、降钙素和细胞生长调节因子 酶类：利用催化反应，达到治疗目的，如tPA, 尿激酶和链激酶等 重组疫苗：防止病毒引起的人和动物传染性疾病疫苗。 单克隆抗体：既可用于疾病诊断，也可用于治疗。 3 举例：糖尿病、胰岛素与基因工程 关于糖尿病：糖尿病是一种常见的内分泌疾病, 是因胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起以糖代谢紊乱为主, 继发脂肪、蛋白质、水、电解质代谢障碍。可分为胰岛素依赖型糖尿病(又称Ⅰ 型) 和非胰岛素依赖型糖尿病(又称Ⅱ型) 胰岛素的结构和作用 结构：胰岛素，有AB两条肽链组成，它们中间通过3个二硫键结合起来，其中A链21个氨基酸，B链30个氨基酸。 功能：胰岛素最显著的生理功能是：一方面提高组织摄取葡萄糖的能力；另一方面抑制肝糖元分解，并促进肝糖元及肌糖元的合成。 关于胰岛素在体内的合成 在生物体内，胰岛素是在β细胞内质网的核糖体上合成的，其合成过程是：前胰岛素原 胰岛素原 胰岛素 胰岛素原，它可以看成是有一条连接肽（简称C肽）的一端通过两个碱性氨基酸（第62、63位）与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过与另外两个碱性氨基酸残基（第31、32位）与B链C末端相连。不同种属动物的C肽不同，例如人的31肽，猪的29，牛的26。胰岛素原保证了胰岛素折叠卷曲，保证了三个位置正确的二硫键的形成。 前胰岛素原，它比胰岛素原的Ｎ末端上多一段肽链，即信号肽，含20个氨基左右，其中多是疏水侧链残基。 生成过程：前胰岛素原在信号肽的引导下进入内质网腔。待肽链进入腔后，立即被信号肽酶切去“前”顺序。形成的胰岛素原后，又被运输到高尔基体然后贮存在贮存颗粒中，并在特异肽酶的作用下转变为活性胰岛素，肽酶催化胰岛素原的二个特定肽键的断裂，释放出一段中间的肽链，这个端肽链又在肽酶的作用下从链的两端各除去2个氨基酸残基而生长C肽。 胰岛素的化学合成 1965年我国科学工作者完成了牛胰岛素的全合成。他们合成牛胰岛素的主要途径是先分别合成A链21肽和B链30肽，再将A、B两条肽链经还原、氧化连接成牛胰岛素、 美国的Merrifield等人报导，他们利用固相多肽合成的方法，合成了胰岛素的A链和B两条链，A链全部用了8天时间，B链用了11天时间。 基因工程生产胰岛素 获得基因途径1：Itakura等人提出的，通过化学合成胰岛素基因再重组表达，即先几十个DNA片段，然后连接起来分别得到A链和B链基因，然后把这两个基因分别表达，再组合成人胰岛素。 但这个方法，二硫键正确配比率比较低，后来有人就合成简化的C肽基因，再连接A、B链构成胰岛素原基因。 获得目的基因途径2： 将前胰岛素原的mRNA反转录成cDNA。 在大肠杆菌中表达途径： 在大肠杆菌中表达途径2： 在酵母中表达 基因治疗糖尿病 基因治疗：是指在基因水平上将正常有功能的基因或其他基因通过基因转移的方式将目的基因导入靶细胞并使之有效表达相应的产物,从而达到治疗某种疾病的目的。 转移基因的靶细胞 根据转移基因的靶细胞不同分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种途径。 生殖细胞基因治疗是，将目的基因直接转入受精卵内。因转基因在受体细胞的随机整合性和可传代性, 以及其对人类长期影响不能完全预知, 并还涉及伦理学的问题, 因此目前尚不考虑生殖细胞基因治疗途径。 体细胞胰岛素基因转移可分为体外和体内两种。前者是先从体内取出部分靶细胞, 经体外培养, 基因转入, 筛选出目的基因所表达的细胞, 再植回体内; 后者则是经静脉或门静脉系统, 直接将有转染能力的重组基因颗粒转入活体内的靶细胞, 这些研究表明体细胞胰岛素基因转移治疗糖尿病是有希望的。 目的基因的导入 目的基因的转入方式有理化方法和生物介导转染法, 而后者占目前已运用的80% , 其中逆转录病毒系统较为成熟, 应用广泛, 在基因治疗中起主导作用。作为基因载体的病毒, 必须首先进行改建, 使其能携带目的基因, 并能定向与特异靶细胞结合, 将目的基因整合到靶细胞的染色体并产生表达。逆转录病毒作为基因转移的载体具有可转染的靶细胞种类多、转染效率高、目的基因可精确地整合到靶细胞的基因组中等优点。 但是, 逆转录病毒介导的基因转移技术也存在着弊端, 即携带基因不能长于8kb, 仅能转染分裂