11 蛋白质(酶、抗体)标记1.pptVIP

2.随机引物介导法制备生物素酰化探针 （三）两种新标记法 扫若仑标记和分子灯塔探针 1.扫若仑标记 扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可达fg级别） 扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量成正比关系 2.分子灯塔探针 概念 用新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针 特征 ①由25个核苷酸组成 ②灯中间环形的15个核苷酸与靶DNA是互补序列；灯竿一端的5个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补 ③在5’ 和3’端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂） 分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光 三、核素标记 标记核酸的核素有32P、33P、35S和3H。其中 32P是制备高比活度放射性探针常用的一种同位素；33P比32P使用安全；35S能量低，不会引起核酸损伤，常用于制备稳定的比活度低的探针，但对许多酶的活性有影响；3H标记的探针常用于原位杂交、核酸的合成和降解分析 由于不同放射性同位素对人体伤害和环境污染程度不同，因此实际操作时根据检测要求结合实验室条件选择相应的标记方法 （一）双链DNA探针 1.切口平移法 原理 类似于非核素DIG标记中的切口平移法，所不同的是，此处用高放射活性标记的核苷酸置换原来的核苷酸 操作要点 将DNase和E.coli-DNA-polⅠ催化的反应分开进行，这样可避免DNase在聚合反应过程中降解DNA 2.随机引物介导法 方法与DIG-随机引物介导法制备DNA探针相似，即用DNase水解小牛胸腺DNA（或鲑鱼精DNA），产生6~12核苷酸的单链DNA或随机6聚合体核苷酸的混合物作为引物；以变性的闭环DNA或线性DNA作为模板，在klenow片段的催化作用下，介导产生DNA探针 分为游离DNA片段为模板和固定DNA片段为模板制备探针 （1）以游离DNA片段为模板制备探针 模板DNA用限制性内切酶消化，电泳纯化或乙醇沉淀后，与其他试剂混合制备探针 （2）以固定DNA片段为模板制备探针 DNA经电泳后，用EB染色，切下DNA色带，加水后沸水浴使其变性，然后37℃（固定），再加其他试剂室温或37℃制备探针 （二）RNA探针的制备（体外转录法） 四、标记物纯化 标记物纯化就是除去未标记的同位素或非同位素产物 并非所有探针都需纯化，通常用于膜杂交的探针不需纯化，而用于原位杂交的探针则需要纯化。常用的纯化方法有萃取/沉淀法、层析法、离心法和电泳法等 （一）EtOH沉淀法 ①加1μl糖原溶液（20mg/ml）到含探针的试管中，混匀 ②加2~3倍体积冷EtOH，低温沉淀，离心分离沉淀，并用少量70%冷EtOH洗涤 ③干燥的沉淀物溶于TE缓冲液中，低温贮存 （二）层析法 SepharoseCL-4B柱层析 层析结果用PAGE检测 SephadexG-50或G-25柱层析 五、探针的鉴定 主要鉴定探针的长度、示踪物的掺入率及特异性 （一）杂交法 用靶DNA或RNA鉴定探针的特异性 根据示踪物的性质，采取相应方法（如荧光、化学发光、酶联免疫等）检测其含量 根据凝胶电泳Rf值检测探针长度 （二）酸沉淀法 主要用于测定放射性核素标记的探针，检测放射性核素的掺入率。 原理：先用强酸（如冰乙酸）沉淀探针（与前体dNTP、NTP分离），再测定其放射性强度；根据放射性强度计算放射性核素的掺入率 （三）色谱法 如用DIG标记的探针其酯溶性增强，可用RP-HPLC分离检测 ? （四）比色法 根据标记物在某条件下能呈色的性质，采取相应的显色剂显色后，比色 （五）发光法 先用紫外照射法将靶DNA交联到膜（如尼龙膜）上，再使探针DNA或RNA与交联到膜上的DNA杂交，封藏，至暗室中暴光，用合适的X线片接收，并用图像仪对印记斑点进行扫描 第二节 蛋白质(酶、抗体)标记 通常抗体与抗原、酶与底物、激素与受体等物质之间发生的特异反