质粒提取步骤.docVIP

煮沸法快速提取质粒以及DNA酶解和琼脂糖电泳 一． 实验目的： 1、 掌握质粒 DNA 分离，纯化的原理 2、 学习煮沸法快速提取质粒 DNA 的方法 3、 学习 DNA的限制性酶切的基本技术 4 、 学习利用琼脂糖电泳测定 DNA片段的长度 二、 实验原理 在基因工程中， DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度， DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 三 ． 实验材料和试剂： 1． 菌种： 含 pUC18 的大肠杆菌 JM107 菌株。 2． 化学试剂和溶液 （1） LB 培养基： NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l 胰蛋白胨 10g/l 氨苄青霉素 50 μ g/ml （培养基灭菌后加入） pH7.0 （2） 70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 （3） STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ） （4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨） （5） 1.2M 氯化钠 （6） TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ） （7） 电泳缓冲液（ 50XTAE ） Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml 使用时用蒸馏水稀释 50 倍。 （8） 样品缓冲液（ 6X ） 0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖 （9） 溴化乙锭 10mg/ml （10） 琼脂糖（电泳级） （11） 限制性内切酶 （12） 溶菌酶（ 50mg/ml ，溶于 10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ） 3.仪器设备: 台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。 Eppendorf 离心管， Tip 头，三角瓶等灭菌备用。 电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（ 20ul, 200ul 和 1000ul ），离心管， Tips(200ul,1000ul) 。 四 ． 操作步骤： 1.质粒提取 （1） 将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在 37 ℃ （2） 将 1.5ml 培养物转入离心管中，用台式离心机在 4 ℃ （3） 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。 （4） 加入 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下 5min 。 （5） 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时 45 秒，取出后立刻离心 10min 。 （6） 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB ，用混合器混匀后，高速离心 5min ，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。 （7） 加入 1.2M 氯化钠 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min ，弃上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE