透射电子显微镜生物样品常规制样技术.ppt

透射电子显微镜生物样品常规制样技术 南京农业大学生命科学 实验中心电镜室 2010.6.21 制样技术中所用的化学试剂 一、固定剂 1、戊二醛 物理特性：带有刺激性气味的无色或淡黄色液体，熔点-14℃，沸点189℃，与水混溶。市售戊二醛一般为25％的水溶液，pH值在2～3.5之间。 性 能：穿透性强、固定迅速、能较好地保存酶的活性。 健康危害：对眼和上呼吸道有强烈地刺激性，长时间吸入或皮肤接触能致敏。 固定作用：醛类固定剂中的醛基对细胞结构具有很高的亲和力，能 制样技术中所用的化学试剂 较好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，对微管、内质网等细胞膜系统和细胞基质具有良好的固定作用。 缺 点：对脂质不起固定作用。 使用浓度：浓度范围为1～6%，一般常用浓度2%～3%。通常用pH 6.8～7.5的 0.2M 磷酸缓冲液配制。 2、四氧化锇 物理特性：四氧化锇俗称锇酸，强氧化剂；带有刺激性气味的淡黄色结晶，熔点40℃，沸点130℃，低于沸点时升华，溶于水。市售四氧化锇一般为0.5克包装，密封于小玻璃安培瓶里，有剧毒。 制样技术中所用的化学试剂 健康危害：吸入、消化道摄入和皮肤接触毒性很强，导致严重烧伤和刺激，蒸气、固体及溶液对皮肤具有腐蚀性，吸入会引起肺水肿。 固定作用：由于它与氮原子有极强的亲和力，所以能与氮基、肽、蛋白质反应，在蛋白质之间形成交联，使其稳定，而且不会形成沉淀。四氧化锇对脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。 缺 点：四氧化锇对 DNA、RNA、糖元和微管等没有固定作用，而且对酶的活性影响很大，因此在细胞化学和免疫电镜实验中应避免使用。 使用浓度：通常使用浓度为1%~2%。 制样技术中所用的化学试剂 二、缓冲液 磷酸缓冲液（PBS)、 二甲砷酸钠缓冲液（CAB） 三、脱水剂 乙醇、丙酮 透射电镜生物样品制备的基本要求 透射电子显微镜常规制样技术也称为超薄切片技术，它是根据透射电子显微镜的性能以及对生物样品的要求的一种样品制备技术。 超薄切片制样技术目前还存在一定的缺陷，制样过程中应根据研究目的的不同，对样品制作的要求应有所侧重。从组织形态学观点考虑，需要尽可能真实精确地保存结构,忽略其组织的机能；从生物化学观点考虑，主要研究的是组织和细胞的机能，对形态的要求有所降低。 透射电子显微镜常规制样步骤 取材 醛类固定 (前固定) 缓冲液清洗 锇酸固定 (后固定) 缓冲液清洗 梯度脱水 环氧丙烷置换 浸渍 包埋 聚合（45℃、60℃） 修块 超薄切片 铀染色 、铅染色 取材的原则和基本要求 （1）取材部位要准确 ▲ 根据实验的目的和要求，选取特征非常明显的正常或病变组织的部位。 ▲如果实验对象是经过一个系列方法（时间系列、浓度系列等）处理，取材时要做到各阶段取材部位尽可能保持一致，这样最终的实验结果才有可比性。 （2）取材要迅速 为了使生物体活体时的状态能够完整的保存下来，取材时必须迅速。 取材的原则和基本要求 生物材料特别是动物材料在离体后，由于组织细胞中的各种酶，尤其是溶酶体中的水解酶迅速释放到组织中，会造成蛋白质、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。 （3）取材时的温度要低 主要是为了降低组织内酶的活性，减少蛋白质和核酸降解的速率。 取材应在0～4℃的低温条件下操作，取材的器械和固定液也要预冷。 取材的原则和基本要求 （4）材料的体积要小 通常戊二醛的渗