第3章细胞工程.pptVIP

2.3 细胞融合技术 细胞融合：是指不同的细胞在离体条件下接触，用无性的方法使其成为一体而产生杂种细胞的技术。植物细胞和微生物细胞常因有细胞壁不能直接用于融合，须经酶法除去细胞壁而得原生质体而后再进行融合，又称原生质体融合。 细胞融合的过程：细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。 促融因子 生物学法：采用病毒促进细胞融合。如仙台病毒。但这种方法存在着许多问题，如病毒 制备困难、操作复杂等，目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。 化学融合剂法：如PEG法：融合的程序大致有以下几步：从双亲分别制备原生质体；混合二亲本的原生质体；诱导融合处理；缓缓加入几滴高pH高钙液，持续15分钟，加入冲洗液，最后将稀释液收集于离心管中，离心收集原生质体；将处理后的原生质体作镜检并作培养。 电融合法：这是80年代出现的细胞工程技术。采用直流电脉冲的诱导，可改变原生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、闭合、产生融合体。电融合的优点是，对原生质体的损害小，融合率高、重复性强。另外，它省去用PEG诱导后必须洗涤的步骤，方法简单。缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。 植物原生质体的制备 （1）取材与除菌 取活跃生长的器官和组织 较脏的外植体要肥皂水清洗再以清水洗2-3次，再浸入70%酒精消毒，用3%次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。 （2）酶解 为除去植物细胞的细胞壁，需经酶解。除菌后的叶片除去下表皮 切块放入反应液不时轻摇 反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。 （3）分离 在反应液中除了大量的原生质体外，还有一些残留的组织块和破碎的细胞。为取得高纯度的原生质体需进行原生质体的分离。可采用过滤法、低速离心法或比重漂浮法。 （4）洗涤 刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，需用新的原生质体培养液离心洗涤2-4次。 （5）鉴定 确认是否已获得原生质体。比如放入低渗溶液中，很容易胀破的就是原生质体。 融合子的鉴定 杂合细胞的显微镜鉴别：根据两亲本原生质体的形状和结构的差异来鉴别杂合体。如一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞就是杂合细胞。 互补法筛选杂合细胞 ：在获得各种遗传突变细胞株系的前提下，可用遗传互补法来筛选杂合子。如甲细胞株缺外源激素A不能生长，乙细胞株需要提供外源激素B才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素A、B的选择培养基上可以生长。 细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体：分子生物学的方法，如染色体核型分析、限制性内切酶片段长度多态性等分析融合子，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。 融合处理后再生长出的植株的形态特征：表型上是否结合了双亲本的遗传素质。 三、动物细胞工程及其在食品工业中的应用 1. 动物细胞工程概述 动物细胞工程所涉及的主要技术有组织培养、细胞融合、细胞拆合、染色体或染色体组转移，以及基因转移等方面，是从细胞结构的不同层次，也就是说从细胞整体水平、核质水平、染色体水平，以及基因水平上来对细胞进行遗传操作的。 根据目前动物细胞工程的发展现况，技术中最成熟、影响也最大的当数细胞融合。其中淋巴细胞杂交瘤在国内外均已普遍开展，其产物单克隆抗体已进入产业化的生产阶段。 2. 动物细胞工程在食品相关领域中的应用 有害物质快速检测 人工合成产品，以及生产过程中排出的废水、废气、废渣中所含的化学物质，这些种类繁多的物质，通过呼吸、饮食和体表接触等途径摄入体内，其中有些会直接危害健康，有些会对人类的遗传有潜在的危险。因此，有必要从存在于人们生活和工作环境中的大量化学物质中，迅速、准确而又简便地鉴别出哪些是有害的，以采取有效的措施减少或消除人们接触这类物质的机会。传统的检测方法是用动物试验。由于肿瘤有物种特异性，所以需要同时用几种动物进行试验。而且一次实验要用大量动物。并且，动物的世代较长。目前在人类环境中的化学物质至少有六、七万种，每年还有上千种新合成的化合物进入人类社会。 利用动物试验来检测遗传效应远远不能适应工业发展的需要。目前已建立了多种快速检测方法，其中之一就是利用离体培养的哺乳动物细胞和人体细胞为材料，可以弥补动物试验费时长、花钱多、收效慢等不足之处。 四、植物细胞工程及其在食品工业中的应用 1.植物细胞工程概述 植物细胞工程主要包括原生质体的培养技术、植物细胞杂交技术、植物单倍体的培养技术等。 单倍体生物是指细胞中仅含一组染色体的个体。由于它们种质纯、不受显性等位基因的掩盖，人们