乳与乳制品病原微生物检验方法志贺氏菌的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法志贺氏菌的检验 YLNB 4.4 1.仪器及器材 1.1 架盘药物天平:0——500g,精确至0.5g 1.2 均质器或灭菌乳钵。 1.3 恒温培养箱：36±1℃，42℃ 1.4 冰箱 1.5 灭菌广口瓶:500mL。 1.6 灭菌锥形瓶:500mL,250mL。 1.7 灭菌平皿:直径90mm 1.8 显微镜：10×——100×。 1.9 硝酸纤维素滤膜:150mm×50mm, 0.45μm。临用时切成两张,每张70mm×50mm, 用铅笔划格,每格6mm×6mm。每行10格,分6行。灭菌备用。 2. 培养基和试剂 2.1 CN增菌液:按GB 4789.28中4.17规定。 2.2 HE琼脂:按GB 4789.28中4.21规定。 2.3 SS琼脂:按GB 4789.28中4.22规定。 2.4 麦康凯琼脂:按GB 4789.28中4.24规定。 2.5 伊红美蓝琼脂(EMB):按GB 4789.28中4.25规定。 2.6 三糖铁琼脂(TSI):按GB 4789.28中4.26、4.27规定。 2.7 葡萄糖半固体管:按GB 4789.28中4.31规定。 2.8 半固体管:按GB 4789.28中4.30规定。 2.9 葡萄糖铵琼脂:按GB 4789.28中3.8规定。 2.10 尿素琼脂(pH7.2):按GB 4789.28中3.15规定。 2.11 西蒙氏柠檬酸盐琼脂:按GB 4789.28中3.5规定。 2.12 氰化钾(KCN)培养基:按GB 4789.28中3.16规定。 2.13 氨基酸脱羧酶试验培养基:赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基,按GB 4789.28中3.12规定。 2.14 糖发酵管:棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷,按GB 4789.28中3.2规定。 2.15 5%乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.32规定。 2.16 蛋白胨水、靛基质试剂:按GB 4789.28中3.13规定。 2.17 志贺氏菌属诊断血清。 3． 检验程序 志贺氏菌检验程序如下: ?检 检 样 25g+GN225ml 25g+GN225ml 36℃±１℃,6－8h HE琼脂或SS麦康凯或EME HE琼脂或SS 麦康凯或EME 挑取可疑菌落 挑取可疑菌落 TSI，葡萄糖半固体 TSI，葡萄糖半固体 如左述的各种发应结果TSI底层产酸，斜面产碱,H 如左述的各种发应结果 TSI底层产酸，斜面产碱,H2S－ 不产气，无动力 进一步的生化试验血清学分析 进一步的生化试验 血清学分析 葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬盐 赖氨酸,尿素,KCN水扬苷和七叶苷生化分群试验 葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬盐 赖氨酸,尿素,KCN水扬苷和七叶苷 生化分群试验 非志贺氏菌葡萄糖铵＋或任何其他阳性结果志贺氏菌分群及分型结果 非志贺氏菌 葡萄糖铵＋或任何其他阳性结果 志贺氏菌 分群及分型结果 非志贺氏菌 非志贺氏菌 报 告 报 告 4．方法 4．1 增菌 称取检样25g,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内,固体食品用均质器以8 000～10 000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒 研磨使其乳化,于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 4．2 分离和初步生化试验 4．2.1 取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个,于36℃培养18～24h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 4．2.2 挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑 几个菌落,以防遗漏,经36℃培养18～24h,分别观察结果。 4．2.3 下述培养物可以弃去: a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物; b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物; c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物; d. 产气的培养物; e. 有动力的培养物; F. 产生硫化氢的培养物. 4．2.4 凡是乳糖、蔗糖不发酵,葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体), 无动力的菌株,可做血清学分型和进一步的生化试验。 4．2.5 生化试验和血清学试验按照GB/T4789.5-2003进行。 5． 结果报告 如果在培养基上无菌落生长，则报告“阴性”或“未检出”；如果有可疑菌落出现，可报告“有可疑菌落”或进一步做生化试验及血清学试验鉴定后报告“阴性”或“阳性”