人心房肌细胞肿胀激活的氯离子电流调节机制及分子结构基础的研究.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 绪 言 肿胀激活的氯离子电流（Swelling-activated Chloride Currents，ICl.swell；或者容量 敏感性的氯离子电流，Volume-sensitive Chloride Currents，ICl.vol）在细胞肿胀或者受 到机械牵拉时激活，目前在所检测的所有细胞均存在。在心脏，该电流被认为参与了 多种生理和病理过程，并被作为心律失常一个潜在的治疗靶点，在过去的十多年该电 流引起了广泛的关注，成为近来的一个研究热点。 细胞肿胀时，通过激活一系列钾离子和氯离子电流，细胞内的钾离子，氯离子丢 失，并伴随水的被动外流，从而使细胞体积恢复，这一过程被称为RVD（受调控的体 积降低，Regulatory Volume Decrease）。RVD对细胞维持正常生理功能有重要的意义， 并被认为参与了细胞凋亡，ICl.swell是RVD的一个关键步骤(1-6)。 ICl.swell具有外向整流性，在生理电位范围内为非时间依赖性，其反转电位接近于 氯离子平衡电位ECl。在生理情况下，ICl.swell的翻转电位介于静息膜电位（Em）和动 作电位（AP）平台期之间（氯离子平衡电位ECl在-35 mV到-65 mV 之间），所以ICl.swell的激活可以缩短动作电位时程（APD）以及有效不应期，并且使静息膜电位去极化(7, 8)。 因为ICl.swell具有外向整流性，所以其对动作电位时程以及有效不应期的影响更为明显。. 动作电位时程及有效不应期的缩短和静息膜电位的去极化可能都在心律失常的形成 过程中起一定作用。早期后除极（EAD）发生于动作电位的2，3期，动作电位时程及 有效不应期的缩短使早期后除极难以发生，因此，ICl.swell的激活可以对局灶触发性心 律失常起到抑制作用，但动作电位时程及有效不应期的缩短使折返波长缩短，这有利 于折返的形成和维持，所以ICl.swell的激活使依赖于多重折返的折返型心律失常，如房颤和室颤等，更容易发生(8)。在正常生理情况下，ICl.swell不被激活，在缺血和再灌注的心肌细胞，细胞肿胀，被认为可能激活了ICl.swell(9,10)。在扩张性心肌病及心衰的动物及人的心肌细胞，ICl.swell被发现持续性激活(11-15)。Reichek(16)，Davies(17)，Probst (18)及 Henry(19) 等指出，房颤患者往往伴有心房的扩大，心房大小和房颤的发生有很强的相 关性。另外，有报道指出在猪(20)、狗(21)及人(22)的心房受到机械牵张后可观察到动作电 5 华中科技大学硕士学位论文 位时程或者有效不应期缩短，与ICl.swell激活后的效应一样。所以，ICl.swell可能参与了与 心肌缺血、再灌注、扩张性心肌病及心衰等相关的心律失常特别是房颤的发病过程。 ICl.swell的调节可能存在种属和细胞特异性。很多蛋白激酶，包括酪氨酸蛋白激酶、 蛋白激酶C、蛋白激酶A、磷脂酰肌醇3激酶、Map激酶以及Rho相关激酶等都被认为 在不同物种，不同细胞调节了ICl.swell，其中酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C受到了广泛关注(8,13,23-36)。α1-肾上腺素受体激动剂可以通过蛋白激酶C途径来调节ICl.swell(34)。有报道 发现在兔心房肌细胞，α1-肾上腺素受体激动剂新福林抑制ICl.swell，同蛋白激酶C激动剂的作用相一致(34)，但在狗心房肌细胞新福林对ICl.swell没有作用(32)。在本课题中，我 们将采用全细胞膜片钳技术探讨α1-肾上腺素受体激动剂新福林及蛋白激酶C激动剂 PDBu对人心房肌细胞ICl.swell的调节作用。有关新福林对人心房肌细胞ICl.swell的调节作 用目前尚未见报道。 ICl.swell分子结构基础仍不是很清楚，CLC-2和CLC-3、P-糖蛋白（P-glycoprotein）、pICln蛋白及磷脂酶（Phospholemman）都被提出是介导ICl.swell的通道蛋白，其中以CLC-3 的可能性最大(1,8,34,37-48)。在本课题中，我们将通过三方面的研究探讨CLC-3与ICl.swell 间关系：全细胞膜片钳技术探讨蛋白激酶C激动剂PDBu对ICl.swell的调节作用；RT-PCR 检测人右心房组织CLC-3 m-RNA并半定量，多元线性回归探讨CLC-3 m-RNA表达量 与心房纤颤、右房横径等的相关性；免疫组化检测CLC-3蛋白的表达，并观察CLC-3 在细胞中的定位和分布。 以下是我们具体的研究内容，由两部分组成： 第一部分：α1-肾上腺素受体激动剂新福林及蛋白激酶C激动剂PDBu 对人心房肌 细胞ICl.swell的调节作用。 第二部分：CLC-3在人右心房组织的