枯草芽孢杆菌产碱蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究.docVIP

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究 摘要：通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。进一步在5L的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为38h，发酵到36h时酶活达到最大 ，酶活最大值为433U/mL，此时pH为8.35，OD600为1.158。可以用pH是否超过8来当作发酵终点的表观特征。 关键词：枯草芽孢杆菌 液体发酵 培养基优化 发酵条件 引言：碱性蛋白酶(Alkaline protease) 广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中[1 ] ，1913 年Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945 年瑞士的Dr. J agg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM(玉米渣) 的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高，但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。本实验通过对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行优化，并对发酵过程进行研究，以期进一步提高枯草芽孢杆菌产粗酶的活力及确定其最佳产粗酶的时间段。 1材料与设备仪器 1.1菌株 枯草芽孢杆菌(由实验室提供) 1.2材料与试剂 福林试剂、三氯乙酸（0.4mol/ L）、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、干酪素溶液(10g/L)氢氧化钠溶液（0.5mol/L）、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙。 1.3 仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、5升发酵罐、离心机、试管、吸管、滤纸、酸度计、高压灭菌锅、超净工作台 、恒温摇床 1.4 培养基 基本培养基：胰蛋白胨5g/L、柠檬酸钠3 g/L、磷酸氢二钾10 g/L、氯化钙3 g 种子培养基：胰蛋白胨5g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、磷酸氢二钾18 g/L 发酵培养基：酵母粉2g/L、胰蛋白胨3 g/L、糊精50 g/L、柠檬酸钠3g/L、、磷酸氢二钾10 g/L、氯化钙3 g/L 配培养基时水用自来水。 2 方法 2.1酶活测定 2.1．1标准曲线制备 表1不同酪氨酸浓度下的吸光值A680 管号 酪氨酸浓度（ug/L） 酪氨酸使用/ml 水/ml 0.4mol/L Na2CO3 吸光值/A680 0 0 0.0 1.0 5 0 1 10 0.1 0.9 5 0.111 2 20 0.2 0.8 5 1.2065 3 30 0.3 0.7 5 0.324 4 40 0.4 0.6 5 0.4165 5 50 0.5 0.5 5 0.52 根据表1，以酪氨酸浓度为纵坐标，吸光值A680横坐标，绘制标准曲线。由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程。令x=1算出y值，即得到吸光常数K的值。 2.1.2 计算酶活公式如下： 样品的酶活力(U/ml)＝（A680*n*k*4）/10 式中：A 为样品平行实验的平均吸光度；K 为吸光常数取96.54；4 为反应试剂的总体积(ml)；10 为反应时间(min )；n 为稀释倍数。 酶活力单位定义为：在温度55℃ pH10.0 条件下，1min 水解酪素产生1μ 2.2摇瓶条件确定最佳碳源 2.2.1配制碳源分别为不同唯一碳源的培养基，在150mL的三角瓶中装25mL并在121 2.2.2以接种量为4%进行无菌 2.2.3在摇床中37 2.2.4把样品稀释成10倍和50倍，在12000r/min离心15min，取上清液测定酶活。 2.2.5 2.3发酵罐过程控制 160 r/min，37℃恒温振荡培养12 h制备种子液，采用5 L发酵罐，接种量为2.5%。发酵罐中的装液量为60%，进行恒溶氧变温发酵。并在发酵开始12h时开始过程控制，每隔2 h 取样，并记录温度、转速、溶氧，发酵液在2 000 r/min，离心15 min，取上清测定发酵液的OD600、pH值、A680并采用福林法测定蛋白酶活力 [1] 3结果与分析 3.1碱性蛋白酶活力测定的标准曲线制备 以酪氨酸浓度为纵坐标，吸光值A680横坐标，绘制标准曲线如图1。 由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程y=96.241x-0.3114，R2=0.9993，算的K